表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测研究.pdfVIP

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测研究.pdf

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建 及其体外表达产物生物活性的检测 邵卫星,彭大新,卢建红,韦栋平,刘玉良,刘秀梵‘ 2 (扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室,扬州,25009) IL一2的启动子结构非常相似,转录因子结合位点也大部分保守。已有多种研究表明IL一2具有免疫增强作 用。鸡痘病毒(FPV)是一种有效的表达载体,现已成功构建数十种表达不同外源保护性抗原的重组鸡 痘病毒。本研究用鸡痘病毒作载体,构建单表达ChIL一2基因的重组鸡痘病毒,旨在研究体内表达的重组 ChlL一2对不同疫苗(如弱毒疫苗,基因工程疫苗)的免疫增强作用,从而开发一种通用的免疫佐剂,同 时也将进一步研究ChIL一2的免疫增强机理。 1、材料与方法 1.1病毒、质粒和主要试剂:鸡痘病毒282E4疫苗株;主要质粒:FPV转移载体p1175、 TotalRNA pBluescript—SKIFN、pGEM—Teasyvector;主要试剂:淋巴细胞分层液、RNAgents Isolation 6Transfection System、ConA、XTT、PMS、转染试剂FuGENEReagent和琼脂糖凝 胶回收试剂盒。 龄鸡胚按常规方法制备原代和次代成纤维细胞(CEF)。 AAA 上痘苗病毒转录终止信号互补序列(AAA 由宝生物工程(大连)有限公司合成。 P1:5 ATGTGCAAAGTACTGATC-3’ 7一CCC鱼鱼垒!垦垦ATG P2:5’一CCCTCTAGA一朋川A/ITTATTTTTGCAGATATCTCAC一3 1.4鸡自细胞介素2(ChIL一2)基因的克隆及序列测定 c, 5%C02温箱中培养。 RNA RNAgentsTotal Isolation 取PCR产物5ul进行凝胶电泳分析。 1.4.3ChIL一2基因序列测定:回收PCR产物,与pGEM—Teasyvector连接。连接产物转化大肠杆 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 有限公司对重组质粒进行序列测定。 1.5插入编码ChIL一2基因的重组鸡痘病毒转移载体P1175IL2的构建:P1175IL2构建的大致过程: ChIL一2 行,过程大致如下:用70%乙醇处理质粒Pi 琼脂(含终浓度为150ug/ml 斑,再按上述方法于96孔板上连续纯化重组病毒数代,直至获得纯化的重组病毒。 C、 为检测重组ChIL一2阴性对照。 x 照。参照1.4.i制备鸡脾单个细胞,调整细胞浓度至I 贮存于4c备用。 I.9测定rFPV—IL2体外表达ChIL一2的生物活性效价 BSA,2ramLG,0.05mM lOug/mlConA,2mg/ml 于4 BSA,2mMLG,0.05mM 2%鸡血清,2mg/ml LG,0.05mM (含终浓度为2%鸡血清,2mg/mlBSA,2ram2一巯基乙醇),调细胞浓度至5X 105/ml,分细胞于96孔u型底的培养板中(5×104细胞/孔)。 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 CEF

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