表达绿色荧光蛋白的重组单核细胞增多性李斯特菌的构建研究.pdfVIP

表达绿色荧光蛋白的重组单核细胞增多性李斯特菌的构建 江玲丽柯春林徐晶靓陈宁方维焕 浙江大学动物预防医学研究所， 浙江省动物预防医学重点实验室 将外源DNA弓[入某种载体构建重组疫苗，可将保护性抗原传递至宿主免疫系统，诱导免疫应答。 细菌和病毒均可作为重组活疫苗载体，其中细菌载体能表达多种不同的外源性抗原。 单核细胞增多性李斯特菌(Listefia 胞和非专职吞噬细胞内存活并繁殖。其毒力主要由五个基因组成的基因簇所决定，依次为plcA、hlv、 膜，使LM逸入胞浆并大量繁殖。LM具有天然佐剂的特征、对抗生素易感、能进入宿主细胞胞浆及 选择性诱导细胞免疫应答等特点，是较理想的重组活疫苗载体。 型10403s，构建成的重组LM经口服或腹腔感染小鼠后，能刺激小鼠产生B半乳糖苷酶特异性细胞毒T 淋巴细胞(CTL)。然而经转座子插入突变构建的重组体外源基因表达水平较低。为了解决这个问 题， 质粒载体，转化LM。这种重组菌能有效地分泌LLO-NP融合蛋白，感染小鼠后产生的cTL能识别和 溶解流感病毒感染的同源靶细胞。 由于质粒表达系统不能稳定地遗传，可能从菌体内丢失。最近采用同源重组技术将外源基因整 合到LM染色体中来构建能稳定表达外源基因的重组LM。Frankel等“构建的重组LM能分泌HIVGag 蛋白到感染细胞的胞浆，其毒力比野生型LMl0403s降低了约3个对数倍数，但其刺激细胞免疫应答的 能力并没有减弱。Shen等”’也应用同源重组技术构建了能分泌LCMV-NP的重组LM，而且基因整合 后并不影响LM的胞内生活周期及肌动蛋白的变化。 fluomsent 绿色荧光蛋白(green 的激发可产生绿色荧光。1974年由Morise等一首先从海洋生物水母中分离出来。与其它报告基因如 氯霉素乙酰转移酶基因cat等相比具有检测灵敏度高、对机体毒副作用小、不需要添加底物或辅助因 子等优点，而且GFP在细胞中呈自主性表达，无需进行细胞或组织的固定或渗透处理，使表达检测 fql 非常简便“。 本研究以GFP为模式外源基因，以李斯特菌hly基因为靶基因，应用同源重组技术构建表达GFP 基因的重组LM。 材料与方法 院微生物研究所宋厚辉博士惠赠，PUCl8、DH5Q、Lm标准菌株10403s由本实验室保存。 I、)(ba 1．2I具酶：限制性内切酶Psi I、KpnI等购自TaKaRa宝生物(大连)公司，TdDNA连接酶、 牛小肠碱性磷酸酶购自上海Sangon公司。 1．3主要试剂盒：胶回收试剂盒购自北京鼎国生物技术发展中心。 1．4细菌DNA抽提(煮沸法)：参照Winters和Abolmaaty…““进行改良抽提DNA模板。 1．5引物的设计及合成 部分序列为反向互补，从而可以通过融合PCR引入XbaI特异性酶切位点。 I) 引物a：TA堡殴￡△GAGGTTTG耵GTGTCAGGTAGAGCG(Pst I) I) TACGAGAGCACCTGGATA I) 弓l物d：TG鱼鱼王△￡￡T GG(Kpn 引物d’GCAAATCAATGCTGAGTGmATGAATC CATGGCCGCGGGATTGA(XbaI) GFP—a：A11≤：至△Q△C I) GFP．b：CGCGCGA砸堡坠坠GT丌GTATAGTTCATC(Xba 228 引物由上海博亚公司合成 1．6同源重组区靶基因片段定点诱变PCR及重组质粒PUCl8-ad的构建 首先进行第一次PCR扩增ab和cd片段，反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃1min，55℃ 45sec，72。C50sec，30个循环；72℃5min，一个循环。纯