肠毒素大肠杆菌亚单位疫苗的研制研究.pdfVIP

摘 要 肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。CS3 是ETEC的优势抗原之一，CS3蛋白是形成ETEC纤毛的结构亚荃单位。为 获得大量的CS3蛋白并研究其理化性质，构建了CS3的大肠杆菌表达载体 pQE-CS3，在IPTG诱导下，获得16.7kDa的蛋白，诱导蛋白占总蛋白的53.8 %。利用Ni-NTA亲和层析一步获得大量的重组蛋白，纯化蛋白量可达到57.88 m留LaSDS分析表明，复性后纯化的蛋白表现为梯状的条带，说明CS3 蛋白形成了一系列的多聚体;在电镜下，可以观察到复性的CS3可以形成 丝状、类似纤毛状结构。GMI-ELISA检测结果表明，这种蛋白聚合物具有 与神经节昔脂GMI结合的能力。 免疫霍乱毒素B亚单位 (CTB)或CS3可使人体对ETEC的感染有保 护作用。为探索研制ETEC双组分亚单位疫苗的可行性，首先利用大肠杆菌 诱导表达系统表达了CTB与CS3的融合蛋白(CTB/CS3)Western印迹结 果表明，诱导表达的29kDa的蛋白具有CTB和CS3蛋白双重抗原性。经 Ni-NTA亲和层析纯化获得重组蛋白CTB/CS3，复性的重组蛋白可以部分形 成五聚体并保留了与GMI结合的能力。动物实验表明融合蛋白CTB/CS3具 有CTB和CS3蛋白的双重免疫原性:同时，CTB的免疫载体作用提高了CS3 的免疫强度。 植物生物反应器是一种安全和廉价的生物系统，尝试利用烟草作为生物 反应器生产CS3蛋白。将CS3基因克隆到质粒pBin438中，构建植物表达 载体pMCS3。在CS3基因中同框融合了烟草病程相关蛋白(PRIb)信号肤 序列，以将CS3蛋白定向分泌到胞外。采用叶盘转化法，将含有pMCS3表 达载体的根癌农杆菌LBA4404转化烟草K326，获得了一批转基因烟草植株。 转基因烟草的PCR和Southemblot分析表明CS3基因己整合到烟草基因组 中，转基因植株的Westernblot显示pMCS3的转基因烟草可以有效的表达CS3 蛋白。己获得了表达CS3的转基因烟草纯合系，其表达量占0.8%TSP。同 时，尝试了利用困H,)2SO;沉淀法和抽真空法获得了较纯的CS3蛋自。这些 结果为利用烟草大规模生产CS3蛋白奠定了基础。 另外，本T作还构建了CTB和CS3融合蛋白的植物表达载体及其DNA 疫苗载体，为比较在不同细胞器中融合蛋白CTB/CS3表达量、评估植物表 达的融合蛋白CTB/CS3和其相应的DNA疫苗结合使用的免疫效果，做了实 验设计和基础工作。 关键词ETEC,CTB,CS3，大肠杆菌表达，免疫原性，转基因烟草 ABSTRACT Kai-xiaMi(Genetics) DirectedbyRong-xiangFang EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)isamajorpathogenthatevokes acutediarrheaamongchildrenworldwideandtravelerstodevelopingcountries. CS3isoneoftheprevalentcolonizationfactors(CFs)foundinhumanETEC strainsandcomposedofamajorstructuresubunitof147aminoacids.Inorderto obtaintheCS3proteininquantityandtoinvestigateitsphysico-chemical characters,6XHis-taggedCS3wasexpressedinEcoli.Theexpressedproteinhad amolecularmassof16.7kDa,asexpectedfromcalculationofitsaminoacids composition.UponIPTGinduction,57.88mgoftheinclusionbodycontainingthe recombinantproteincouldbeobtainedfromoneliterculture,whichaccountedfor about53.8%ofthetotalEcoliproteinasdet