WesternBlot详解及问题分析PPT.ppt

膜的选择主要根据： a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 湿转系统 半干转移系统 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。 转膜后检测（此步可以省略） 封闭 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。 一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP) 碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物； 辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑TMB氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。 另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 ① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存 ②?AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66micro;lNBT溶液和33micro;l BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。 ③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间） 膜解吸方法（膜的重复利用） 通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。 蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。 Western Blot结果分析 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为： 阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）； 阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）； 空白对照（不加一