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酵母蔗糖酶的分离纯化
酵母蔗糖酶的分离纯化 生化技术综合系列实验(一) 原理 生物大分子 蛋白质 酶 生物大分子提取基本步骤 材料 破细胞 提取 纯化 检测 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。 低温保持酶活性 蔗糖酶提取步骤 1.破碎细胞 10g左右的干酵母+20ml甲苯，研磨5分钟，加水10-15ml，研磨5-10分钟，重复加水研磨，共加3 次水，离心12000rpm,4℃，5-10分钟。共分3层，上层白色为甲苯及其抽提物，中间为水层(含酶)，下层为细胞碎片沉淀(甲苯和水体积不用准确） 2.抽提(第一组分) 取中间水层于干净离心管，12000rpm, 4℃，5-10分钟，上清取出量体积并记为V1，然后留2ml保存于冰上后面做检测，其余的样品（V1-2ml）继续进行纯化 3.热抽提(第二组分) 调pH约5.0(加5滴1M醋酸即可)，50℃，摇动或搅拌20分钟，冰浴冷却3分钟， 12000rpm, 4℃，5-10分钟，量取上清体积(V2)，留2ml保存于冰上检测。其余样（V2-2ml)继续提纯。 4.乙醇沉淀(第三组分) 热抽提后的样品中（V2-2ml)加等体积95%冷乙醇，低温温和搅拌10分钟， 12000rpm,4℃，5-10分钟，沉淀于吸水纸上沥干(将离心管倒置于吸水纸上2分钟)。沉淀溶于10ml Tris.Cl缓冲液中，溶解5分钟， 12000rpm,4℃，5-10分钟，取上清,留下3ml冰上保存检测。 将留下的一、二、三组分样标记清楚后保存于-20 ℃冰箱中。 注意事项 1.低温 2.一、二、三组分的准确体积V1、V2、V3 3.标记 4.离心后弃、留 5.记录现象 * *
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