膜片钳实习.pptVIP

离子通道特征 离子通道等效于电导 欧姆定律 离子通道的电导与膜电位有关 膜片钳电记录电路 贴附式记录（ Cell-attached recording） 全细胞记录（Whole-cell recording） 内面向外记录（Inside-out recording） 外面向外记录（Outside-out recording） 记录方式的选择 记录方式的选择取决于实验的需要 全细胞记录: 用于检测整个细胞的活动，例如，要记录突触引发的兴奋性突触后电流 (EPSC) 或用于研究所有通道的平均活动及调制。 全细胞记录小脑颗粒细胞（P12）的谷氨酸能EPSC 记录方式的选择 外面向外膜片： 通常用于研究配体门控性离子通道，可以将激动剂施加到胞膜的外表面观察与配体结合位点结合后的电流变化 记录方式的选择 贴附式记录 ： 用于研究“正常”环境下的离子通道。 膜片的切割会引起通道特性的改变，同时还会引起通道活动所需蛋白或酶的丢失。 贴附式记录最适用于验证可通透性信息物质对通道的调制。 胞外Ca2+对持续性K+ 通道的抑制 去除胞外Ca2+ 后K+ 通道活动增加 恢复胞外高Ca2+ 水平后K+ 通道的活动又受抑制 在本例中通过胞外低Ca2+ 可获得高强度K+ 活动 毒蕈碱(Muscarinic)激动剂抑制K+ 通道 去除Oxo-M后K+ 通道活动恢复 记录方式的选择 内面向外膜片： 通常用于研究药物与通道蛋白胞内区结合后对通道活动的影响。 利用内面向外膜片可记录到NMDA单个通道电流 CAM-KII施加于内面向外膜片后增加NMDA通道开放时间 Axopatch200B（AXON，USA）规定膜片钳记录中电流的方向为： 阳离子从放大器流出到记录的膜片中，记到的是正向电流，在电流曲线中记录为向上偏移。 阳离子从记录的膜片中流向放大器，记到的是负向电流，在电流曲线中记录为向下偏移。 阴离子相反。 钳制电位的确定 膜电位或钳制电位的计算取决于钳制方式； 膜电位(membrane potential) 用Vm表示， 通过放大器给予的命令电位(command potential)为 Vc， 静息膜电位(resting membrane potential)用RMP表示。 对全细胞和外面向外记录: Vm = Vc 对贴附式记录: Vm = RMP – Vc 对内面向外记录: Vm = -Vc 可用实验对象 膜片钳技术成功的关键取决于用于记录细胞的表面是否清洁。如果细胞表面足够“清洁”，那么理论上任何细胞都可形成膜片钳记录。最常用于膜片钳记录的标本有： 培养细胞 急性分离细胞 脑组织薄片 转染有离子通道克隆的细胞 单通道I/V曲线可用于计算单个离子通道的电导 示例：急性分离的大鼠额叶皮质锥体细胞（FCX）全细胞记录 急性分离大鼠额叶皮质（FCX）细胞的形态（200×） Low Ca2+ Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Oxo-M Low Ca2+ 由于Oxo-M加到整个细胞表面而非单独的膜片，这种抑制作用应该是这种可通透性药物从胞内对K＋通道作用的结果 Low Ca2+ From Selyanko Sim (1998) J.Physiol. 510, 71-91 + Glu 脂质层的外表面 脂质层的内表面 + Glu 脂质层的外表面 脂质层的内表面 + CAM-KII From: Lieberman Mody (1999) Nature Neurosci. 2, 125-132 脑片膜片钳技术 （引自： Stuart et al., 1993） （引自：Ascher P, 1989） 10μM 10μM a b （引自：The Axon Guide》1993） 1．表面清洁法 （Surface cleaning 法） 2. 红外微分干涉相差显微镜法（IR-DIC法 ） 3.盲法 （Blind 法） Axopatch 200B （AXON，USA） Fast magnitude , Fast time constant（τ） 钮 Slow magnitude , Slow time constant（τ）钮 WHOLE-CELL CAP钮 膜片钳系统中的电位（电压）与电流 钳制电位（Holding potential, Vh） 人为地将细胞膜内外电压差固定在某一数值，这一数值即为钳制电压或钳位电压。实施这一行为的技术为电压钳技术（Voltage clamp）。 命令电压（Command voltage, Vcmp） 通过