Ad5-hBDNF-EGFP体外转染rMSCs及其在CGP-NgR抗体水凝胶中的生长研究.docVIP

精品论文 参考文献 Ad5-hBDNF-EGFP体外转染rMSCs及其在CGP-NgR抗体水凝胶中的生长研究 王长昇 许卫红 张立群 吴朝阳 　　福建医科大学附属第一医院脊柱外科 350005 　　摘要：目的 以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因，观察干细胞生长情况及两者间生物相容性。方法 WST-1法检测rMSCs增殖效应，Western blot法检测hBDNF蛋白的表达。结果 CD34、CD45、CD29、CD90阳性细胞比率分别为0.79%、6.8%、98.9%、99.9%。结论 Ad5-hBDNF-EGFP能成功转染接种在水凝胶上的rMSCs，两者间具有良好的生物组织相容性。 　　脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）治疗目标是减少继发性损伤，改善SCI局部微环境，挽救受损的脊髓神经元；利用各种手段和方法促进神经再生和整合，实现脊髓结构性恢复与功能重建，为了获取基因工程干细胞hBDNF-rMSCs并进行联合培养，观察干细胞生长状况以及两者间生物相容性。 　　1.材料与方法 　　1.1材料 　　1.2SD大鼠，体重（110plusmn;30）g由福建吴氏实验动物中心提供，许可证号：闽B2 将体质量（110plusmn;30）g SD大鼠乙醚过度麻醉致死，无菌条件下获取骨髓细胞并进行分离、培养，48h后首次换液，之后约3~4d换液1次，当细胞生长至80~90%融合时继续传代。取培养至第3代的干细胞进行实验。流式细胞仪检测CD34、CD45、CD29、CD90表达情况。 　　1.3统计学方法 　　计量数据采用（?xplusmn;S）表示，应用SPSS11.0软件包进行统计分析，多组之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用最小显著性差异（leastsignificant difference，LSD）检验；取Plt;0.05为差异有统计学意义。 　　2.结果 　　2.1rMSCs的鉴定结果 　　流式细胞仪检测第3代rMSCs表面抗原，CD34、CD45、CD29、CD90阳性细胞比率分别为0.79%、6.8%、98.9%、99.9%。 　　2.2荧光显微镜观察细胞荧光表达 　　B、C组细胞转染后3d，置于荧光显微镜下观察，见细胞中有大量绿色荧光信号表达。（图1） 　　图2 rMSCs接种于C/GP-NgR抗体水凝胶上AO染色（times;100） 　　①为培养3d的AO染色；②为培养7d的AO染色 　　2.4WST-1法检测水凝胶上rMSCs生长情况 　　rMSCs培养1~7d呈时效性增殖，A、B、C各组3、5、7d细胞增殖显著增加，与1d时比较，差异有统计学意义（Plt;0.05）；培养5d，C组细胞增殖较A、B组明显增加（Plt;0.05），A、B两组无明显差异。（表1，图3） 　　表1 各组rMSCs接种于水凝胶上培养增殖情况（ plusmn;S） 　　图4 细胞培养至5d，各组hBDNF蛋白表达水平比较 　　①：凝胶电泳结果；②：曝光胶片图光密度分析（hBDNF与beta;-actin OD比值） 　　1、2、3分别为NgR接枝组，hBDNF组、hBDNF+C/GP-NgR组；**Plt;0.01 VS 1；#Plt;0.05 VS 2 　　3.讨论 　　骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是存在于骨髓的一类成体干细胞，属于非造血干细胞群，具有高度增殖能力和多向分化潜能，在体内、体外均有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。 　　本研究中B、C组水凝胶中加入MOI为100的重组腺病毒进行转染并继续培养至第3d，荧光显微镜下观察细胞中有大量绿色荧光信号表达；培养5d，Western blot法检测B、C组均有hBDNF蛋白表达，C组明显，A组表达阴性。更有利于rMSCs的生长、繁殖及神经细胞方向分化；C/GP-NgR抗体水凝胶与MSCs具有良好的生物组织相容性。 　　参考文献： 　　[1]王长昇，林建华，吴朝阳重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的构建及体外转染rMSCs后基因表达研究.解剖学杂志，2011，34（5）：637-640. 　　[2]张弩，吴宇.温敏性壳聚糖水凝胶复合细胞因子修复兔关节软骨缺损[J].中国组织工程研究，2012，16（34）：6298-6302. 　　[3]黄舒洁.含hTK1和hTIMP1双基因共表达重组腺病毒载体的构建及对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响[D].福建医科大学，2013.