AGEN 中文版去内毒素大提试剂盒.docVIP

纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL 准备工作： 1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1) 2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water) 3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P1 4.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解 5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill 6.细菌扩增培养 补充： 准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合 1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA 5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制 准备1个冰浴盒用于步骤6 准备室温下的异丙醇10.5ml 4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳 步骤：peocedure A.细菌培养、收获和裂解 bacterial culture,harvest lysis 1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度； 6000×g；15min ?? 从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液） ?? 抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基) ?? 培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠 溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。 ?? 可将离心后菌块-20摄氏度下冰冻保存暂时终止实验。 2.于10ml Buffer P1中重悬浮resuspend细菌沉淀bacterial pellet，混匀 ?? 必须重悬彻底，涡流振荡器或移液器反复吹打至没有菌块 3.加入10ml Buffer P2，剧烈vigorously翻转invert4-6次混合，置于incubate室温5min ?? 在室温孵化期间准备QIAfilter 过滤筒cartridge：在滤筒出水口outlet喷嘴nozzle拧上screw帽子，将滤筒置于管架备用 ??加入buffer P2后不要使用涡流振荡器(以免剪切细菌DNA)，裂解反应不要超过5分钟。buffer P2用完要拧紧盖子以免酸化。 4.加10ml预冷的 Buffer P3，剧烈翻转4-6次混合 加入buffer P3后析出绒毛样物质(细菌DNA，蛋白，细胞碎片和KDS)，裂解液粘性下降。如果裂解液仍然粘稠度大，说明混合不够。 很重要的是混合好后迅速倒入滤筒，以防止扰动沉淀层。 B.细菌裂解清除 bacterial lysate clearing 5.将裂解液倒入pour滤筒内，置室温(15-25摄氏度)10min，不要套入滤筒活塞plunger！从喷嘴处取掉滤筒的帽子，缓慢轻柔的将活塞插入滤筒并滤过细菌裂解液于50ml试管中 ?? 在静置的10分钟里不要搅动滤筒内的裂解液。析出物会慢慢上浮于上层。如果过了10分钟析出物未浮在上层，可用消毒的移液器枪尖驱赶滤筒壁上的析出物。 ?? 取120ul过滤后裂解液样本(Sample1)用于实验后分析胶，确定生长和裂解条件是否最佳。 6.加2.5ml Buffer ER 到过滤好的裂解液中，翻转约10次使其混合，冰浴30min C.结合、洗涤和抽提质粒DNA bind,wash elute plasmid DNA 7.用10ml Buffer QBT 平衡equilibrate QIAGEN-tip 500，并保持重力流动gravity flow排空柱筒empty column 8.使用第6步骤得到的过滤裂解液加入QIAGEN-tip柱中使其重力流动通过树脂resin ?? 取120ul通过树脂后的裂解液样本(Sample2)用于实验后分析胶，确定质粒DNA结合于树脂的效率。 9.2×30ml Buffer QC洗涤QIAGEN-tip ?? 第一步洗涤质粒准备过程中大多数污染物，第二步洗涤特别针对培养液过多或所用菌种含糖量较多的情况。 ?? 取240ul洗涤液样本(Sample3)