川芎嗪对窒息新生大鼠脑组织ｐ５３蛋白表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 川芎嗪对窒息新生大鼠脑组织Ｐ５３蛋白表达的影响 李文英（浙江大学医学院附属妇产科医院新生儿科　浙江　杭州　３１０００６） 　　【中图分类号】Ｒ９６５ 　【文献标识码】Ａ 　【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０６３８－０１【摘要】目的探讨川芎嗪对新生鼠窒息后脑组织内Ｐ５３蛋白表达的影响。方法将６０只７日龄新生ＳＤ大鼠随机分为对照组、窒息组和治疗组（各２０只）。窒息组常压窒息，治疗组在窒息前和窒息后即刻各腹腔注射川芎嗪（４０ｍｇ／ｋｇ）一次，而对照组和窒息组均注射同体积生理盐水。各组于造模后以ＴＵＮＥＬ法和ＳＰ法分别检测海马区神经元凋亡数与Ｐ５３阳性细胞数量变化。结果对照组海马区几乎无Ｐ５３阳性细胞及凋亡神经元，窒息组及治疗组海马区Ｐ５３阳性细胞及神经元凋亡数量均显著高于对照组（Ｐ ＜０．０５），而治疗组海马区神经元凋亡和Ｐ５３阳性细胞数量均较窒组息减少（Ｐ＜０．０５）。结论川芎嗪可能通过抑制窒息新生大鼠脑组织Ｐ５３的表达而减少神经细胞的凋亡，从而对窒息脑损伤起到保护作用。 　　【关键词】川芎嗪；窒息；新生大鼠；凋亡；Ｐ５３　　 　　围生期窒息常导致新生儿缺氧缺血性脑病（ｈｙｐｏｘｉｃ．ｉｓｃｈｅｍｉｃｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＨＩＥ）的发生，研究表明凋亡为ＨＩＥ中神经元死亡的主要形式［１］。Ｐ５３蛋白是细胞凋亡的调控因子，通过调节相关凋亡因子的表达而诱导细胞凋亡的发生［２］。既往研究证实川芎嗪具有抗调亡及脑保护作用［３．６］，但川芎嗪是否可以通过抑制Ｐ５３的表达而抑制窒息诱导的神经细胞调往未见报道。 　　１材料和方法１．１实验药品与仪器鼠抗人Ｐ５３单克隆抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司），ＳＰ免疫组化试剂盒（中杉公司）等。 　　１．２实验动物与分组新生７日龄ＳＤ大鼠６０只随机分为对照组、窒息组和治疗组各２０只，各组再分为１２ｈ、１、３、７天组，每组各５只。 　　１．３动物模型制备采用新生鼠常压窒息模型［７］，在容积为５５ｍＬ的磨口瓶中分别装入０．００５ｋｇ钠石灰，然后将新生大鼠分别置于磨口瓶中，待动物安静后，用凡士林涂抹瓶口，塞紧瓶塞，开始密闭３０ｍｉｎ后打开瓶塞复氧。对照组模拟此过程不塞瓶塞（不做缺氧处理）。治疗组在窒息前和窒息后每日腹腔注射川芎嗪（４０ｍｇ／ｋｇ）［６］，而对照组和窒息组均在相同时间点注射同体积生理盐水。 　　１．４取材与切片三组新生大鼠分别于窒息后不同时间点（１２ｈ、１、３、７ｄ）断头处死，脑组织于４％多聚甲醛中固定，酒精脱水氯仿透明石蜡包埋，经海马区连续切片（片厚５ｕｍ），分别用于细胞凋亡检测及Ｐ５３免疫细胞化学反应。 　　１．５ＴＵＮＥＬ染色检测细胞凋亡及ＳＰ法检测Ｐ５３蛋白表达按试剂盒说明操作，每张标本随机选取海马区各５个高倍视野（４００倍），计数每个视野中阳性细胞数，取其平均值作为该切片的阳性细胞数。 　　１．６统计学分析采用ｓｐｓｓ１３．０软件进行统计学处理，数据以均数plusmn;标准差（ｘplusmn;ｓ）表示，同一指标多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 　　２结果２．１窒息后不同时间点的ＴＵＮＥＬ染色结果ＴＵＮＥＬ染色阳性细胞为细胞核染为棕褐色。对照组海马区偶见阳性细胞，对照组各时间点无明显差异（Ｐ＞０．０５）［窒息组各时间点海马区每高倍镜视野阳性细胞数分别为７．２０plusmn;１．４８、１２．５０plusmn;２．１２、８．５３plusmn;１．９５、５．０２plusmn;１．１３，较对照组显著增加（Ｐ＜０．０５），［川芎嗪治疗组海马区阳性细胞数均较窒息组显著减少（Ｐ＜０．０５）。 　　２．２Ｐ５３的免疫组化染色结果Ｐ５３阳性细胞的细胞核染为棕褐色。 对照组大鼠海马区几乎无Ｐ５３阳性细胞表达；窒息组大鼠脑组织海马区Ｐ５３阳性细胞数量在各时间点均较对照组明显增加，其各时间点海马区每高倍镜视野Ｐ５３阳性细胞数量分别为１０．６３plusmn;１．５４、８．０２plusmn;０．７８、７．３３plusmn;０．９８、７．１２plusmn;１．２１；川芎嗪治疗组各对应时间点海马区每高倍镜视野Ｐ５３阳性细胞数分别为５．４１plusmn;１．２１、６．８８plusmn;１．５３、５．３９plusmn;１．４０、２．６９plusmn;０．９８，组间比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（图２）。 　　３讨论围生期窒息所致ＨＩＥ是引起新生儿死亡和神经系统发育障碍的重要原因之一。目前对于ＨＩＥ发病机制的研究认为该病涉及多种因素参与［１］。近年来，随着对细胞凋亡机制的深入研究，神经细胞凋亡在ＨＩＥ发病过程中所起的作用越来越受到关注。新生鼠缺氧缺血性脑损伤后，大脑皮质和海马区均可见大量神经元出现凋亡［８］。本实验发现