蛋白水解酶转肽使猪胰岛素转成人胰岛素.docVIP

蛋白水解酶转肽使猪胰岛素转成人胰岛素 杨纪庆 林志新 俞吉安 (生物科学与技术系) 摘 要 利用赖氨酸专一性的蛋白水解酶 (L y t icu s p ro tea se) 进行了酶促人胰岛素半合成反 应, 猪胰岛素经该酶切去 B 链羧基端丙氨酸形成去丙氨酸胰岛素 DA I (D e le t io n A lan in e In 2 su lin ). 进一步在水?有机溶剂介质中该酶的转肽反应, 使 B 链生成苏氨酸叔丁酯羧基末端, 水 解去酯后产生人胰岛素. 研究了转肽反应的最佳条件. 转肽反应生成的人胰岛素具有较强的生 物活性. 关键词 人胰岛素叔丁酯; 去丙氨酸胰岛素; 转肽反应 中图法分类号 Q 51; Q 57 胰岛素是胰脏胰岛细胞产生的一种小分子蛋白质激素 ( 相对分子质量5 700). 胰岛素能促进糖尿病 患者血液中葡萄糖的利用, 从而使血糖降低1 . 目前, 应用基因工程和蛋白水解酶的转肽方法已成功地 生产出人胰岛素2 ～ 4 . 但基因工程方法生产人胰岛素投资大, 工艺复杂, 成本较高; 而猪胰岛素经酶促转 肽方法投资省且简单易行, 加之中国猪胰岛素资源丰富, 因此, 有很好的应用前景. 胰岛素由 A 、B 两条链共51个氨基酸组成. 比较不同动物来源的胰岛素发现, 猪胰岛素一级结构与 人的相差最小, 其中, A 链完全相同, B 链仅羧末端氨基酸不同, 猪胰岛素为丙氨酸, 而人胰岛素为苏氨 酸. 从胰岛素分子特点来看, B 链羧末端倒数第二个氨基酸为赖氨酸, 且整个分子也只有这一个赖氨酸; 另外, 胰岛素 B 链羧末端的肽链比较松散, 位于分子表面, 易为酶作用. 唐建国等5, 6 用胰蛋白酶成功地 进行了由猪胰岛素到人胰岛素的转肽反应。但是, 胰岛素 B 链上存在另外一个胰蛋白酶的作用位点 B 22 精 氨 酸, 这 样 便 产 生 了 一 个 无 法 避 免 的 副 反 应, 生 成 去 八 肽 胰 岛 素 DO I (D e le t io n O c tagop ep t ide In su lin ) 和相应的去八肽胰岛素酯副产物, 而且难以与人胰岛素酯产物分离, 给生产带来困难. 本文使用 一种蛋白酶, 只水解肽链赖氨酸羧基侧肽键, 避免了胰蛋白酶副反应的发生. 材料与方法 ( 1) 赖氨酸专一性的蛋白水解酶 ( 简称蛋白水解酶). 由上海交通大学生物科学与技术系保藏菌种 分离纯化得到. (2) 猪胰岛素. 徐州生化制药厂制品. (3) L 型苏氨酸. 日本味之素株式会社制品. (4) L 型苏氨酸叔丁酯的制备7 . 苏氨酸叔丁酯用硅胶薄板层析鉴定. 展层液是正丁醇? 乙酸? 蒸馏 水= 3? 1? 1, 用茚三酮显色. ( 5) 去丙氨酸胰岛素 (DA T ) 的制备. 猪胰岛素和蛋白水解酶各 2 Λm o l?L , N H 4H CO 3 缓冲液0. 1 m o l?L , pH 8. 3. 反应在37°C 进行. (6) 丙氨酸释放量的测定8 . (7) 酶促转肽反应. 在水?有机溶液中进行. 反应系统: DA I 1 mm o l?L , T r is2H C l 缓冲液 0. 5 m o l?L , pH 6. 5, 苏氨酸叔丁酯, DM F ?乙醇 67% , 蛋白水解酶 0. 2 Λm o l?L. ( 8) 聚丙烯酰胺凝胶电泳. 用10% 胶浓度. 浓缩胶、分离胶及电泳缓冲液的 pH 值分别为6. 8, 8. 8和 8. 3. ( 9) 胰岛素生物活力测定. 采用小白鼠惊厥法, 实验组小白鼠注射胰岛素; 对照组小白鼠注射生理 盐水. 1 收稿日期: 1996203219 第一作者: 男, 1969年生, 硕士生. 上海, 200030.  猪胰岛素酶促转变成人胰岛素的工艺路线见图1. 图1 猪胰岛素转变成人胰岛素的工艺路线 1- 胰蛋白酶作用位点, 2- 赖氨酸专一性蛋白酶作用位点, 3- 水解去酯 图2 丙氨酸的释放曲线 2 结果与讨论 2. 1 去丙氨酸胰岛素 猪胰岛素在蛋白水解酶作用下水解, 释放出丙氨酸. 用茚三酮显色法对释放的丙氨酸量进行测定 (OD ) 570 (表示在570 nm 处的光密度) , 结果见图2. 从图2可见, 反应体系中丙氨酸浓度随着时间的延长 而升高. 24 h 后, 90% 的猪胰岛素 B 链羧末端的丙氨酸被水解下来. 测定前应对取出的样品反复冷冻干 燥, 以除去 N H 4H CO 3 , 减小误差. 2. 2 苏氨酸叔丁酯 从图3可见, 绝大多数苏氨酸与叔丁醇反应生成了酯, 残余的苏氨酸不参与转肽反应. 苏氨酸叔丁酯 的迁移率为0. 62. 图4 转肽