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猪精液冷冻保存技术 吉林省农业科学院 猪场动力网 李兆华 内 容 猪精液冷冻保存的意义 猪精液冷冻技术研究概况 猪精液冷冻技术操作流程 影响猪精液冷冻效果的因素 如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力 猪场动力网 1、延长公猪使用年限； 2、获得更大的遗传进展； 2、取代活体公猪的引进； 3、生物安全的保证。 猪精液冷冻保存的意义 猪场动力网 从意大利人Spallanzani最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有200多年的历史 。 猪的精液冷冻研究是从1949年英国人Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。1956年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作，并进行人工授精。 1957年Hess等将猪冻精经子宫颈输入，并产下仔猪。 1975年，Pursel等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。 （用颗粒状冷冻精液给23头青年母猪输精, 48h后剖检11头,有5头受孕; 25-30d后剖检另外12头,有10头怀孕） 猪精液冷冻技术研究概况 猪精液冷冻技术研究概况 我国从70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。 1975年西安市草滩农场试配了8头母猪 。 1977年成立了全国猪冻精协作组。 1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头， 近几年： 甘肃农业大学 张兆旺教授 南京农业大学 芮荣教授 西北农林科技大学 李青旺教授 四川农业大学 马恒东教授 东北农业大学 刘娣教授 上海农科院 张德福研究员 猪场动力网 猪精液冷冻技术操作流程 精液采集 质量检测 第一次稀释 降温、平衡 （15℃， 5℃ ） 第二次稀释 平衡 冷冻 保存 猪场动力网 猪精液冷冻技术操作流程 颗粒法冻精的冷冻程序 1)新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.5～2h; 2)缓慢降温至15℃维持4h，再从15℃经1h降至5℃; 3)用等温的含甘油的II液进行稀释。 4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。 利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为1～2cm，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110～-125℃，滴冻时间控制在60s内完成，加盖熏蒸平衡3～4 分钟后，浸入液氮中保存。 细管法和塑料袋法的冷冻程序 1)新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡0.5～2h。 2)将精液移入15℃条件下降温平衡3h。 3)在15℃条件下离心(800g，10min), 加入无甘油的I液，缓慢降到5℃，平衡2h，加入含甘油的II液，然后分装。 4)程序冷冻仪冷冻： 初始温度为5℃，以3℃／min从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以50℃／min从-5℃降到-140℃，然后投入液氮保存。 5)液氮熏蒸冷冻： 在广口液氮罐内，与液氮面距离5cm处，熏蒸20分钟，然后投入液氮保存。 猪场动力网 影响猪精液冷冻效果的因素 个体的影响 个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态(AFLP)分析控制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究 冻前处理的影响 冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。 猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高 胆固醇/磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜 离心：800g，10min 猪场动力网 影响猪精液冷冻效果的因素 冷冻保存承载工具的影响 承载工具：颗粒、0.25mL、0.5mL小型细管和扁平细管； 5mL 的大型细管 5mL塑料袋。如FP(Flat-Pack，300mm×22mm×0.2mm)和MFP(a multiple Flat-Pack)。 冷冻解冻程序的影响 冷冻速率：30～50℃/min。解冻速率：1200～1800℃/min 冷冻 0.25mL微型细管：50℃/min、1.5％甘油浓度； 0.5mL小型细管：30℃/min、3％甘油浓度； 5mL大型细管：16℃/min 、3.3％甘油浓度。 解冻 0.25mL、0.5mL细管：50℃，12s或37℃，20s； 5mL细管：50℃，40s 5mL塑料袋：50℃，13s 猪场动力网 影响猪精液冷冻效果的因素 稀释液的组成 大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。 渗透压的影