丹宁_聚乙二醇法提取纤维素酶的研究.docxVIP

丹宁2聚乙二醇法提取纤维素酶的研究吴慧清黄小茉李剑英吴清平(广东省微生物研究所 , 广州 , 510070)摘 要 木霉经固态发酵制成纤维素酶湿曲 ,按曲水体积比 1∶5 加入 40 ℃去离子水 ,保温 60min 后 ,过滤获得粗纤维素酶液 。在酶活为 F Pase 2216 u/ mL 的稀酶液中 ,加入丹宁至 510 g/ L 时 ,粗酶液中纤维素酶接近完全沉淀下来 ,将沉淀分散于 p H416 的 011 mol/ L 柠檬酸缓冲液中 ,加入分子质量为 6 000 u 的聚乙二醇 ( P E G) 至丹宁含量的 116～410 倍 ,酶活回收率达到210 %～245 % ,可将纤维素酶浓缩 7 ～ 8 倍 。P E G 对纤维素酶有激活作用 ,采用丹宁作为纤 维素酶的沉淀剂 , P E G 可将纤维素酶从酶2丹宁复合物中解析出来 。丹宁 、P E G 的用量与酶液中的蛋白质含量有关 , P E G 超过解析酶用量的一定范围 ,因激合纤维素酶使酶活回收率超过 100 % ,过多 P E G 会使系统发生相改变 ,从而使酶失活 ,使得酶活回收率急剧降低 。关键词 纤维素酶 丹宁聚乙二醇 提取法丹宁是一种多酚类物质1丹宁酸 (简称丹宁) :分析纯 ,中国遵义市第二化工厂 ,贵州 ; 聚乙二醇 ( P E G) : 分子质 量 8 000 u 、6 000 u ,进口分装 ; 羧甲基纤维素钠 ( CMC) : 上 海 长 虹 塑 料 厂 产 品 , 粘 度 ( p H611) 013 ～ 016 Pa ·s ; 滤纸 : 新 华 1 号 定 性 滤 纸 ;纤维素酶曲 :木霉菌种 ,经固态发酵制成 。1 . 2纤维素酶活力的测定纤维素酶活力单位定义为 : 60 min 水解 生成 1 mg 葡萄糖的酶量为 1 个活力单位 。1 . 2 . 1羧 甲 基 纤 维 素 酶 ( CMCase) 活 力 测定12 ,13取待 测 稀 释 酶 液 015 mL , 加 入 5 g/ L CMC 溶液 115 mL , 50 ℃酶解 30 min ,加入 3,能与蛋白质结合生成不溶于水的复合物 。在找到一种将酶或蛋白质从这种复合物中解析出来的方法 以前 ,丹宁对酶来说是一种失活剂 。因此丹宁沉淀法作为酶的提取方法 ,一直未能获得大规模的工业应用 。后来 ,人们找到了几种 将酶从 丹 宁 与 酶 的 复 合 物 中 解 析 出 来 的 物 质 ,这些物质主要为聚乙二醇 ( P E G) 、聚乙烯氮戊酮 ( PV P) 、聚氧化乙烯或山梨糖醇的甘油油酸酯 ( PO E·S·MO) 或硬脂酸 ( PO E·S·M S) 2 ,这为丹宁沉淀法的工业应用开辟道 路 。用丹宁沉淀法制备的酶制剂不含盐 ,纯 度高 ,不但符合食用的要求 ,而且可以作为口服药用酶制剂3 ,亦可用于纺织加工和发酵13mL DN S 试剂,沸水浴 10 min ,在波长 530nm 比色测定还原糖的含量 。1 . 2 . 2滤纸糖酶 ( F Pase) 活力测定4 , 51 mL 稀释的待测酶液 ,加入 0105 mol/ Lp H416 的柠檬酸缓冲液 1 mL 和 1 条 1 cm ×6 cm 新华 1 号滤纸 , 50 ℃酶 解 60 min , 加 入 3mL DN S 试剂 ,沸水浴 10 min ,在波长 530 nm比色测定还原糖的含量 ,扣除空白后计算酶 活力 。113制备浓缩液态纤维素酶制剂的工艺过工业等4 ～9。迄今为止 ,丹宁沉淀法已用于α2淀粉酶 、酸性蛋白酶 、糖化酶 、脂肪酶 、果胶酶等水解酶的提取 ,但酶活损失大3 ,10 。本 研究在利用丹宁沉淀纤维素酶后 ,采用聚乙二醇解析和激活纤维素酶 ,可以有效地提取 粗酶液中的纤维素酶 。1材料和方法1 . 1材料第一作者 :硕士 ,工程师 。收稿时间 :2000 - 11 - 20 ,改回时间 :2001 - 04 - 0642Vol127 No18食品与发酵工业Food and Fermentatio n Indust ries程2 . 2丹宁酸对纤维素酶的沉淀作用取 6 份 100 mL 经浸提 、离心后 F Pase 为2216 u/ mL 的稀酶液 ,按稀酶液量加入 110 ,210 ,310 ,410 及 510 g/ L 的丹宁酸 ,搅拌后 ,在室温下放置 3 h ,离心 ,收集上清液和沉淀 物 ,测量上清液中的酶活力 。结果表明 ,当丹宁加量达到 510 g/ L 时 , 粗酶液中纤维素酶几乎可以完全沉淀下来 (表 2) 。表 2 丹宁加量对纤维素酶沉淀的影响将固态的纤维素酶浸提液经压榨或离心制得粗酶液 ,加丹宁酸将酶沉淀下来 ,离心 , 弃去上清液 ,将沉淀用介质将