第六章 目的基因的转化.ppt

第六章 目的基因的转化 第三节 发根农杆菌Ri质粒基因转化 发根农杆菌的纯化培养 被转化植物材料的预培养和切割 菌株在植物外植体上的接种和共培养 诱导毛根的分离和培养 转化体的确认和选择 转化体毛状根的植株再生培养 转化体的生物测定和分析 发根农杆菌基因转化的影响因素： 发根农杆菌的种类及浓度 植物种类及外植体类型 外植体预培养及共培养时间 培养基类型、激素、酚类等化学因子 光照、温度、pH值、伤害处理等物理因子 发根农杆菌转化的应用 促进生根 增强抗逆性 次生代谢产物生产 第四节 植物病毒载体介导基因转化 植物病毒的侵染机制： 病毒先黏附于细胞膜上，两者的膜相并合，病毒的遗传物质由并合处进入细胞质，或者由于膜的卷曲病毒进入细胞质，然后脱去套膜和壳膜，放出遗传物质。接着在分子水平上进行如下的过程： DNA进入细胞核，在宿主细胞系统下进行DNA复制； mRNA将病毒信息传到细胞质； mRNA利用宿主细胞蛋白质合成系统合成病毒蛋白质； 蛋白质一部分残留在细胞质内，结合到质膜上，另一部分进入到细胞核内，组成病毒衣壳； 病毒颗粒进入到细胞质，在质膜上发育； 发育成熟的病毒颗粒排到细胞外。 病毒载体转化系统的基本条件 病毒的核酸中应该包含目的基因； 作为载体的病毒本身必须能够在植物细胞中正常复制增殖，又不至于过分扰乱寄主的正常生理功能； 病毒接种的方法必须简单可行，以适合较大规模的实际应用； 病毒基因能耐受修饰改造以改变某些生物学特性，主要就是减弱或消除病毒的致病性； 病毒基因组能耐受插入报告基因、目的基因等，同时又不改变病毒的特性。 病毒载体转化的优点 简便易行、廉价、能与常规育种紧密结合； 现有的许多转基因技术都可以应用于病毒的基因转化，如电击法、基因枪法、原生质体法、共培养法、脂质体法等； 脂质体在介导植物病毒RNA的转化方面应用很多，脂质体包裹植物裸露RNA后，与原生质体在特定的融合条件下保温，可获得较高的感染率。 病毒载体与质粒载体转化系统的比较： 植物病毒载体能把外源基因直接导入到宿主细胞，而Ti质粒载体是通过侵染转化等复杂的转移过程而完成； Ti质粒载体将外源基因整合到植物核DNA上，而植物病毒载体不影响宿主细胞核基因组的结构，从而防止无限传代扩散，比较安全可靠； 病毒载体具有高效的自我复制能力，转化植物可得到高拷贝的外源基因，有利于外源基因的表达和功能实现。Ti质粒载体一般拷贝数低，外源基因蛋白产物低于细胞可溶性蛋白质的1%； 病毒能系统侵染整株植物，避免再生培养，可较快地获得转基因植物； 植物病毒的寄主范围较广，一种病毒基因组构建的载体可用于多种不同的植物的遗传操作。 病毒载体缺点： 外源基因没有整合到基因组，遗传不稳定； 病毒载体仍然存在致病的可能性； 病毒载体中的外源基因很容易丢失。 第五节 DNA直接导入法基因转化 化学诱导DNA直接转化 PEG介导基因转化 脂质体介导基因转化 2. 物理法诱导DNA直接转化 电激法介导基因转化 超声波介导基因转化 显微注射介导基因转化 激光微束介导基因转化 基因枪法介导基因转化 低能离子束介导植物基因转化 PEG介导基因转化 PEG、多聚L-鸟氨酸、磷酸钙及高pH条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。PEG使细胞膜之间或DNA与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。 转化步骤： Ti质粒DNA提取，或直接提取植物的DNA作为目的基因； 原生质体分离； 转化培养。质粒与原生质体一起保温培养，加入PEG，pH8-9； 离心收集原生质体，或用钙离子溶液使PEG逐步稀释； 筛选转化子。 PEG法优点： 对细胞伤害少，转化顺利； 再生植株来源一个原生质体，避免嵌合体产生； PEG法转化的原生质体易于选择转化体； 受体植物不受种类的限制，只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用PEG法转化。 PEG法缺点： 原生质体再生系统建立比较困难； 转化率低； 原生质体再生的无性系植株变异较大； 脂质体介导基因转化 脂质体是根据生物膜的结构功能性合成人工膜，然后把DNA包裹在人工膜内。将脂质体与原生质体在适当的培养基中混合，加入PEG或PVA，再用高pH、高钙离子溶液漂洗，通过原生质体的吞噬或融合可将外源DNA导入受体细胞。 转化步骤： 用反相蒸发法制备脂质体； RNA或DNA核酸制备； 脂质体纯化； 脂质体原生质体保温培养转化； 转化原生质体选择培养。 电激法介导基因转化 电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。 转化步骤： 分离原生质体，加入电激缓冲液悬浮； 加入质粒DNA和鲑鱼精DNA； 冰浴5分钟； 选择不同参数电激； 筛选培养。 特点： 同样具有PEG原生质体转化的优点； 操作简便； DNA转化效率高； 适于瞬时表达的研究；