临床样本保存及处理方式.docxVIP

临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。临床标本的处理血清（浆）标本一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选 择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清 进行检测，或-20oC保存。全血标本通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。前处理：1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 SDS可与蛋白 质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过 程中必须除去。痰标本痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。具体方法：用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，↓加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化↓取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟↓12000 rpm，离心15分钟↓弃上清，加无菌生理盐水1 ml ，混匀，12000rpm离心5分钟↓弃上清，沉淀物用于 DNA提取棉拭子用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等），临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。具体方法：加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm ，离心5分钟用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物（由医护人员采集），置无菌试管或EP管内弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟具体方法：加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm ，离心5分钟↓用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物（由医护人员采集），置无菌试管或EP管内↓弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟↓同上，重复洗涤一次↓弃上清，沉淀即可用于DNA提取体液体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理：加等体积红细胞裂解液，震荡混匀，置5-10分钟↓10000rpm，离心5分钟，弃上清↓可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取脓液粘稠脓液：同痰标本处理，先用4%NaOH液化，再离心取沉淀提取DNA。水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。组织组织有新鲜组织和石蜡切片。新鲜组织的处理步骤：先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。标本的保存血清（浆）HBV：分离出的血清（浆）如不立即提取核酸，保存于-20℃待检。HCV：尽快分离血清(浆), 如不立即提取RNA， 保存于-20℃待检。长期保存：吸取200μl血清，加20u RNasin（RNA酶抑制剂），保存于-70℃。已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保存1-2周（时间长短根据报告单上的承诺而定）。全血标本全血标本如用于DNA提取，可4℃下短期保存（数天），时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。最好将DNA或RNA提取后，置-70℃保存。痰液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。组织新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。