流式细胞术系列之-细胞凋亡分析.pptVIP

细胞凋亡检测 细胞凋亡过程 凋亡的检测方法 1. 形态学检测 光学显微镜 荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI ) 电子显微镜 2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（可用FCM） 3.线粒体膜势能的检测 （可用FCM） 4. DNA片断化检测 （可用FCM） 5. TUNEL法 （可用FCM） 6. Caspase-3活性的检测 （可用FCM） 7. 凋亡相关分子的检测（可用FCM） 促凋亡分子: Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid 等 抑凋亡分子: Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等 8. 相关信号通路分子的检测（可用FCM） 线粒体膜势能的检测 【原理】 线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡则不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 常用染料有：Rhodamine 123 、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide [DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等 DNA片断化检测 通过PI染色，分析亚二倍体峰（凋亡峰），方法同“DNA倍体分析和细胞周期分析” TUNEL法 流式也能进行TUNEl检测，其检测原理与经典TUNEl原理基本一致。利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。 流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点，经典TUNEl是做不到的。 Caspase-3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子。 Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。 用荧光标记的抗活化Caspase-3的抗体进行胞内染色，可以通过流式细胞术分析其活性 在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降 * 细胞凋亡与疾病的关系—— 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染 不足与过度并存：动脉粥样硬化 凋亡与疾病 在凋亡诱导因素的作用下 线粒体的膜电位改变 caspase家族激活 磷脂酰丝氨酸外翻 DNA断裂 形成凋亡小体 磷脂酰丝氨酸外翻分析(ANNEXIN V标记法) 【原理】 细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸（PS）外翻； Annexin-V能与PS高亲和力特异性结合 ； 碘化丙啶(propidine iodide, PI)可以区分活细胞和死细胞。 操作步骤 Falcon管按顺序编好阴性对照管和标本管号 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1? Binding Buffer缓冲液制成1?106的细胞悬液 Falcon试管中加入100ml细胞悬液 标本管加入FITC标记的Annexin-V（20mg/ml）10ml，室温避光20min 然后加PI（50mg/ml）5ml，轻轻混匀，室温避光10min 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照 各试验管中加入1?Binding Buffer缓冲液400ml 1小时内上流式细胞仪测定结果 结果分析-优 结果分析-差 如何获得好的结果 细胞状态要好； 细胞处理的火候问题：药物浓度、时间需要摸索； 染色后，不能固定细胞，应尽快检测。 【方法】 将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。 【注意事项】1． 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。2． 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。 结果分析 经典TUNEL法原理 结果分析 结果分析 结合细胞DNA含量分析效果更佳 *