以动物细胞系统大量制造活性蛋白质preparationoflarge.pdfVIP

第十一章 以動物細胞系統大量製造活性蛋白質 Preparation of Large-scale Active Proteins Using Animal Cell Culture System 吳 燦 輝 環球基因生物科技股份有限公司 研發生產部 經理 一、 前言 動物細胞培養技術很早即建立，初期常因微生物的污染受困擾，至 1913 年 Carrel 將外 科無菌操作技術應用在動物細胞培養上，細胞始能長期培養而不受污染。1916 年 Rous 及 Jones 利用胰蛋白 （trypsin ）由組織中分解細胞，發展出附著性細胞的次培養法 （subculture ）。在1948~1952 期間，mouse 纖維母細胞(fibroblast)和HeLa 兩種細胞株先後 被 Earle 與 Gey 等學者建立。1955 年 Eagle 開發生化學配方培養液(chemical defined medium) ，使得細胞培養不必再依賴體液培養。配合分子生物與生物科技技術的進展，1975 年Kohler 和Milstein 研發出融合瘤（hybridoma ）技術，之後被廣用於單株抗體的製備。80 年代第一個由動物細胞製造的重組蛋白組織胞漿素原激活(tissue plasminogen activator; t-PA) 由美國Genentech 公司以中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell ，CHO)正式 生產。 在培養角瓶(T-flask)進行的小量細胞培養是確立一株新細胞或用以研究細胞形態及比較 不同試劑對細胞生長與代謝之影響的最佳細胞培養方式。但是有愈來愈多的應用需要使用大 量的動物細胞，例如：萃取細胞組成份(如 109 細胞可以提供 7 mg DNA) ；使用大量細胞培 養病毒以製備疫苗(一般每批次使用 5x1010 細胞) ；以及許多醫藥用重組蛋白製劑之生產，如 干擾素(interferon) 、紅血球生成素(erythropoietin) 、胞漿素原激活 、酵素、賀爾蒙、快速檢 驗試劑與抗體，規模達到 10,000 L 之動物細胞培養在生物科技產業製造過程已被廣泛使用。 這方面的進展已由昂貴、花費人力提升至大規模的’單元操作’系統(unit process system) 。雖 然單元操作系統可以節省成本且更有效果，但是將其使用於細胞培養放大生產仍需一系列的 修改以克服一些大量生產的限制因子，例如氧氣限制、剪力傷害(shear damage) 、養分的供 給以及大量新陳代謝產物的生成與排除，在本章以下的內容將針對這些大量生產的限制因子 提出討論。 以動物細胞做為生產活性蛋白的一個重要考量點在於動物細胞合成的蛋白質可正確折疊 (folding) 形成四級結構且蛋白質釋放出細胞之前會進行一系列轉譯後修飾作用 157 (post-translational modification) ，其中最重要的是醣化作用(glycosylation) ，醣化作用對蛋白 的生物活性表現以及在人體中代謝速率有極大影響性，所以現在表現醫療用活性蛋白常使用 動物細胞為宿主。目前動物細胞可依其性質、形態及培養特質來分類，以其性質來分有初代 細胞（primary cell ）、正常細胞（normal cell ）及持續性細胞株（continuous cell line ）三種。 初代細胞是直接以胰蛋白將動物組織或器官加以分解而得；正常細胞是指具成對染色體， 培養時須有培養表面供其附著，單層長滿後即不再繼續增生，可用胰蛋白讓這些細胞脫離 附著面進行繼代培養，但無法永續地培養，有一定生長代數。相反地，細胞株則可持續地培 養。生物蛋白製劑生產所使用的細胞依其形態則可分類為纖維狀（fibroblast-like ）及表皮狀 （epithelial-like ）兩種不同的細胞。若以培養時是否需要附著面，又可分為懸浮性 （suspension ）及附著性（adherent ）兩種細胞。懸浮式細胞培養是一種最易於放大生產培 養的方式，因為 1 L 培養槽在概念上與 1000 L 培養槽是相似的，只是對於環境控制及維持細 胞生長之正確生理環境需要