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不同浓度山茱萸多糖对HDF细胞衰老影响 　作者：欧芹 黄秋实 张慧丹 张昆 李晶 朴金花 【摘要】 目的 研究不同浓度山茱萸多糖对体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)的影响，探讨制备含山茱萸多糖家兔血清的最佳采血时间。方法 选择家兔为对象，制备含山茱萸多糖血清，DMEM培养基培养复制性衰老HDF细胞;采用苯酚硫酸法测定多糖含量，MTT法检测细胞活力。将HDF细胞分为4组，观察不同浓度含山茱萸多糖家兔血清培养基对衰老HDF细胞细胞活力的影响。结果 血清中山茱萸多糖浓度在给药1.5，2，4 h明显高于给药0.5、11 h(Plt;0.001)，给药2，2.5，3，3.5，4 h高于0.5、11 h(Plt;0.01)，而在给药48，72 h则明显降低(Plt;0.01)。培养基中加入含山茱萸多糖兔血清(SCP)0.5%、1%和1.5%均能提高衰老HDF细胞活力(Plt;0.01),细胞衰老表型不明显，其中1%SCP组效果好于0.5%，1.5%组。而2%SCP组和 3%SCP组表现明显的细胞生长抑制。结论 制备含山茱萸多糖家兔血清最佳取血时间是在给药后1.5～2 h或4 h，山茱萸多糖抗HDF细胞衰老作用效果最好的是1%含山茱萸多糖兔血清组。 【关键词】 山茱萸多糖;人胚肺二倍体成纤维细胞;衰老;血清 山茱萸具有补肝肾、益精气、降血糖、抗菌、利尿、降压和免疫功能〔1〕。现代药理学研究表明山茱萸具有抗氧化、抗实验性肝损害、促进免疫反应、抗类风湿关节炎、抗炎、降血糖、抗休克、强心、抗艾滋病、治疗不育症、抗癌和降血脂等作用〔2〕，有良好的应用前景。但是不同浓度含山茱萸多糖血清的制备过程中家兔血液的最佳采样时间、对HDF细胞衰老作用及理想用药剂量的研究目前未见报道。本研究为进一步开拓山茱萸多糖的临床应用，探讨其药理作用及机制奠定实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 HDF细胞系(南京凯基生物公司)，小牛血清、胰蛋白酶、MTT 粉、DMSO(北京华美公司)，DMEM(Invitrogen 公司)。家兔25只，由佳木斯大学实验动物中心提供。 　　1.2 山茱萸多糖(FCP)含药血清的制备及测定 　　1.2.1 含药血清的制备 家兔按每公斤体重78 mg生药提取的多糖给药，连续给药7 d。给药前心脏取血1 ml作为空白对照，在给药后0.5，1，1.5，2.0，2.5，3，3.5，4，5，6，7，9，11，24，48 h分别心脏取血1 ml，静置析出血清后，4℃ 12 000 r/min离心20 min，56℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤。细胞培养用含药血清的制备：连续灌胃5 d，最后一次灌胃1.5 h同法制备含药血清，采用同种灭活法制备正常兔血清(SB)，分别混合SCP和SB，-20℃保存。 　　1.2.2 血清中含药浓度测定 采用苯酚硫酸法〔3〕。①标准曲线绘制：以葡萄糖作对照，以质量浓度C对625 nm吸光度A进行线性回归,A=0.007 98+4.317C，r=0.997 2;②含药血清FCP的测定：取100 μl供试样品加乙醇250 μl，漩涡混合1 min,静置10 min,12 000 r/min,离心15 min,沉淀加蒸馏水1 ml混匀后12 000 r/min,离心5 min,上清液冻干，加重蒸水溶解定容至1 ml，采用马振宇等方法〔4〕处理血清，苯酚硫酸法测定血清中多糖的含量，每份样品重复测定5次。以时间为横坐标，血清中多糖浓度为纵坐标，做浓度时间曲线。 　　1.3 FCP血清药理作用的研究 20代HDF细胞作为青年对照组，用含10%小牛血清的DMEM 培养液培养至45代，分为对照组和山茱萸多糖血清(SCP)实验组，SFCP实验组又分为0.5%SCP组(0.5% SCP +9.5%SB)、1% SCP组(1% SCP +9%SB)、1.5% SFCP组(1.5% SCP +8.5%SB)、2%SCP组(2% SCP +8%SB)和3% SFCP组(3%SCP +7%SB)，并以SB作对照(衰老组)。小于35代为年轻细胞，大于55代为衰老细胞。采用MTT法检测细胞活力，常规显微镜下观察细胞形态学变化。 　　1.4 统计学处理 数据以x±s表示，组间比较采用t检验。 　　2 结 果 　　2.1 给药不同时间家兔血清多糖含量的变化 对10只家兔给药不同时间多糖浓度测定的结果，见图1。在给药后1.5 h和4 h出现2个最高浓度时间的变化，在两个高峰之间维持平均浓度在15.467 μg/ml的较高浓度状态，在给药6h后开始出现下降。而培养用药物血清多糖浓度为22.86 μg/ml。 　　2.2 不同浓度SCP对HDF细胞形态学变化的影响 青年组细胞生长状态良好，细胞排列整齐，呈长梭形或不规则形