Th1-Th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达影响.docVIP

Th1/Th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达影响 　 作者：代继宏，王永红，何海霞 【摘要】 目的：初步探讨IL13和IFNγ对支气管哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子NGF表达的影响. 方法： 建立Wistar大鼠哮喘模型，分离脾淋巴细胞并培养，通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)半定量法测定NGF mRNA的基础，12 h， 24 h水平，并观察予以干扰素(IFNγ)和白细胞介素13(IL13)干预后NGF mRNA表达的情况. 结果： 哮喘大鼠脾淋巴细胞在基础状态下具有表达NGF mRNA的功能，并在ConA刺激下呈时间依赖性增强，IL13组随着干预时间的延长基础NGF mRNA表达量逐渐升高，呈现时间和浓度依赖性，并且至12 h后分别高于各时间点的空白对照组(均Plt;0.01). 而随着IFNγ干预浓度的依次增高，NGF mRNA表达相对值却逐渐降低，也表现出浓度和时间依赖特征. 结论： 在哮喘中Th2类细胞因子IL13可上调淋巴细胞NGF mRNA表达，Th1类细胞因子IFNγ可下调淋巴细胞NGF mRNA表达，两者均呈时间和浓度依赖性；Th1/ Th2类细胞因子免疫失衡可能通过调控NGF mRNA表达间接促进其诱导神经源性气道炎症. 【关键词】 哮喘；神经生长因子；白细胞介素13；干扰素Ⅱ型 0引言 　　哮喘是严重威胁公众健康的疾病，目前该病的病因、发病机制还不十分清楚，相关研究已经证实在哮喘发病过程中，T细胞亚群(特别是Th1/Th2)功能失衡在哮喘发病中有重要作用. 白介素13(IL13)和γ干扰素(IFNγ)分别是Th2和Th1效应细胞的细胞因子，在哮喘发病机制中，两者之间的不平衡是引起免疫球蛋白E(IgE)产生异常和哮喘发病的重要因素，即Th2细胞占优势的反应导致一系列由IgE介导的变应性炎症［1］. 然而，在Th1/Th2失衡中占主导作用的免疫细胞与神经元的相互作用机制仍不清楚. 　　神经生长因子(nerve growth factor， NGF)是神经营养因子家族中的成员之一，其主要功能是调控神经元的生长与分化. 研究表明，NGF作为神经可塑性调控因子，通过诱导神经源性炎症反应参与哮喘发病［2］. 我们通过建立大鼠哮喘模型，探讨大鼠体内Th1/Th2免疫失衡和神经源性炎症之间的关系. 1材料和方法 1.1材料4只雄性Wistar大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，鼠龄4～6 wk，体质量120～200 g，饲养1 wk后建立大鼠哮喘模型. 大鼠IL13和IFNγ(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；FicollHypaque分层液及刀豆素(ConA)购于美国Sigma公司;总RNA抽提试剂盒购于华美生物工程有限公司；逆转录试剂盒购于Promega公司；Taq酶购于TaKaRa公司；Trizol试剂购于美国Molecular Research Center；NGF的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司. PE4500 PCR热循环仪系美国Sigma公司出品；Avant 30低温高速离心机和Du70全自动紫外分光光度计系美国Beckman公司出品. 1.2方法 1.2.1哮喘模型的建立每只大鼠腹腔内注射抗原液1mL(其中含鸡卵蛋白100 mg，灭活百日咳杆菌疫菌5×109个和氢氧化铝干粉100 mg)致敏，2 wk后开始用超声雾化器每日给予10 g/L鸡卵蛋白雾化吸入60 min激发哮喘，观察症状，连续2 wk，建立哮喘模型［3］. 取肺组织行病理检测. 1.2.2细胞分离、培养及干预 1.2.2.1脾淋巴细胞分离以颈椎脱臼法处死大鼠，放入盛75 mL/L乙醇的烧杯中浸泡2～3 min后置超净工作台上，用无菌眼科剪和眼科组织弯钳取脾，并置于盛有冷DHanks液(10 mL)培养皿中的筛网上，剪成2～3段，用2 mL注射针芯捻碎. 将细胞悬液移入10 mL离心管中，离心(1500 r/min×5 min)，弃上清后加入6 mL TrisNHCl破坏红细胞，用吸管吹打混匀后室温下放置5 min，离心(1500 r/min×5 min)，弃上清，DHanks液重悬细胞；取5 mL FieollHypaque分层液(比重为1.087)于另一离心管底部，将细胞悬液轻铺分层液表面离心（400 r/min×20 min），吸取单核细胞层；DHanks液洗涤细胞3次，加RPMIl640培养液10 mL悬浮细胞，将脾单核细胞悬液移入培养皿中，置37℃培养箱中贴壁1 h，使单核/巨噬细胞黏附于玻璃壁上，用毛细吸管吸出未贴壁的淋巴细胞悬液. 取100 μL脾淋巴细胞悬液稀释后用0.4 g/L的台盼蓝染色，计数并观察细胞活力；调整