细胞生物学实验指导08级.docVIP

细胞生物学实验指导 姚雪梅 编 苏 州 科 技 学 院 2009年8月 （一）细胞培养技术 实验目的： 1．了解细胞培养的基本方法 2．掌握通过聚乙二醇为介导物融合细胞的方法 实验原理： 动物机体的各种组织或器官从机体取出后，经处理分散成单个细胞，加入适量培养基，置合适的培养容器中，在一定的条件下培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 细胞借助于物理、化学或生物的方法可以实现两个或多个细胞间的融合。PEG是一种常有的细胞融合剂。 实验过程： 细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，细胞培养技术是从事细胞与分子生物学研究最基本的工具之一。 本实验的基本步骤是：细胞培养液的配制、原代培养、传代培养 一、细胞培养液的配制 许多生物技术公司将不同的培养基制成粉剂出售，一般实验室只需购买相应的粉剂培养基即可。下面以DMEM培养基为例说明配制方法。 首先将DMEM培养基放入1000ml烧杯中，加入80％规定量的双蒸去离子水800ml，搅拌5－10分钟至完全溶解，以pH计或pH试纸调整pH至7.0－7.3，移入量筒，补足双蒸去离子水至规定量1000ml，准备过滤除菌。 培养基的过滤最好采用正压过滤系统。取滤膜加于两层滤纸之间，装上滤膜及管道系统，用纱布扎好出液口，装入布袋，与盛装培养基的瓶子一起于15磅，121℃高压消毒15分钟。于超净台内接好充气球，在储液瓶中加入配好的培养基，向储液瓶中充气，分装过滤后的培养基，标记培养基名称及配制时间，于4℃保存。 如果少量过滤，则可以使用一次性滤器，用注射器吸取液体滤于盛装容器中。 小牛血清使用前需先灭活，56℃水浴30分钟，不断振摇，超净台内分装10－20ml，于－20℃保存。进行细胞培养时，吸取除菌后的DMEM培养基，并记下体积，取灭活的小牛血清，按10％浓度加入瓶中，混匀后即可使用。加有血清的培养基称为完全培养基。有些培养基需补加抗生素、谷氨酰胺、碳酸氢钠等添加成分，可以按要求配成高浓度储存液，过滤除菌后分装小份，每次使用前以加小牛血清类似的方式加入，混匀后即可使用。 二、原代培养 新鲜组织来自无菌动物实验或手术无菌标本。取新鲜组织浸入无菌清洗液Hanks中清洗，移入青霉素瓶，用无菌眼科手术剪剪成1－3mm3的小块，用清洗液反复清洗，弃去带血上清液，用弯头吸管移小组织块于培养皿中，注意组织块间应保留一定距离，于37℃，5％CO2培养箱中静置2－4小时后，组织块紧贴瓶皿底部，轻轻加入少量培养基浸盖组织块，于37℃，5％CO2培养箱中培养7天后，细胞从组织块底部长出，补足多量培养基，继续培养4－6天，细胞逐渐增殖至长满后可以进行传代培养。这期间每3－5天更换一次培养基。 另外还可以采用化学消解法即用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等使组织中细胞连接被解除，游离为单细胞悬液，进行原代培养。 三、传代培养 根据细胞增殖速度不同，可以进行1：2、1：3、1：4传代培养，目前较常有的是胰蛋白酶消化法。取已长满细胞的培养瓶，吸去培养液，以D-Hanks液清洗，加入0.25％胰蛋白酶消化液，相差显微镜观察，胰酶消化前，细胞间隙较紧密，消化后，可见贴壁细胞变圆预脱落，加入完全培养基，以终止消化作用。用弯头吸管将细胞自瓶壁吹下，移至10ml无菌离心管中，将管塞紧，以1000rpm，离心5分钟，离心后可见细胞沉淀于离心管底部，除去上清，加入1－2ml完全培养基制成细胞悬液，计数后按一定比例分于新的培养瓶中，补足培养基，于37℃，5％CO2培养箱中半开放式培养。 正常细胞传至一定代数后即逐渐死亡，一些肿瘤细胞可以在体外无限传代成为细胞系，来自单细胞增殖的细胞群体又称为克隆。 讨论问题： 1．Hanks液为何物？ 2．小牛血清的比例是否有其它的？ 3．为什么用相差显微镜观察？ 4．为什么消化后加入完全培养基即可终止消化？ （二）单克隆抗体技术 实验目的： 了解单克隆抗体的制备过程 实验原理： 根据肿瘤细胞可以无限增殖、B细胞可以分泌抗体的特点将他们在体外融合，通过一定的筛选方法得到既可以分泌特异抗体，又可以无限增殖的融合细胞。 实验过程： 利用细胞培养和细胞融合技术，使体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与具有抗体分泌能力的小鼠脾淋巴细胞进行融合，形成的杂交细胞存活，一方面保留了骨髓瘤细胞无限增殖的能力，另一方面保留了脾脏细胞分泌抗体的能力。通过一定的筛选步骤使这些杂交细胞以单克隆的形式生长，即可鉴定出分泌单一抗体的杂交瘤细胞系，这一过程就是单克隆抗体技术。 这项技术包括①抗体分泌细胞的分离；②细胞融合；③特异抗体分泌的检测；④阳性孔进一步单克隆化等一系列连贯过程。 一、抗体分泌细胞的分离 以纯化抗原常规免疫小鼠，每次0.2ml，多点注射，融合前3天静脉注入抗原，加强免疫一次，眼球取血，回收血清作为阳性对照。 两个无菌瓶皿中预先加有