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碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨 An Effective Method to Recover DNA from Agarose gel 生物技术 2004年02期曹阳 , 董晓宇 , 姜国斌 , 乌兰 , 安利佳 采用碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中的DNA,达到分离纯化目的,回收后的DNA可用于重组、PCR等研究.首先将含有目的DNA的琼脂糖凝胶用NaI溶液融解,然后加入CaCl2和NaHCO3,生成CaCO3沉淀,DNA与CaCO3形成复合物,通过离心分离出沉淀复合物,利用稀酸溶解沉淀,再用无水乙醇沉降,即可回收目标DNA.利用该方法回收了质粒、毛白杨和转基因羊基因组DNA,回收率为20％～50％,OD260/OD280为1.7～1.9,最大回收了21kb片段,最小回收250bp片段,回收后的DNA样品进行了PCR扩增和限制性内切酶反应,PCR可以扩增出目的片段,同时限制性内切酶可以将回收后的DNA切开,表明DNA质量良好.利用碳酸钙沉淀法可以回收琼脂糖凝胶中的DNA,此法简单、易行,较为有效.DNA重组实验中的常用技术 点击次数： 29 ? 发表于：2008-06-18 14:53　转载请注明来自丁香园 来源：互联网　 ? 五、真核细胞基因组的制备 从不同组织细胞或血细胞中提取是进行基因诊断的先决条件。制备的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取的反应体系中，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞 膜；（2）解聚细胞 中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使分子尽量完整地分离出来。具体方法如下： （一）白细胞的制备 （1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2 灭菌30min）抗凝。 （2）将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2 、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞 完全溶解。 （3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，STMT重复处理1～3次。 （4）弃上清，白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置37水浴15～20h。 （5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm离心5min。 （6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醇（24：1）抽提，3000rpm离心5min 。 （7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1），抽提，3000rpm离心5min。 （8）小心吸取上层水相，加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀，-20过夜。 （9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml 75%乙醇4静置1h，离心，10000rpm 10min。 （10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。 （11）加200μl 1×TE溶解，置4保存。 （12）对所提用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。 （13）取2～4μl 样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提的质量及降解情况。 （二）组织的制备 （1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。 （2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。由于从核中释放出来，样品变得粘稠。 （3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37保温1～3d，直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。 （4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。 （5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段，并移入一新管，吸干中的无水乙醇。 （6）溶于4ml 0.1×SSC中，4过夜可作进一步纯化。 （7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 保温5h。加0.4ml 5mol/