生化实验报告-姜慧敏.docVIP

生物化学综合实验 植物中SOD的分离提取及性质研究 姓名：姜慧敏 小组成员：刘平，何燕刚，阳烨 学号 班级： 生物工程10-1班 学院：生物与食品工程学院 时间：二零一二年六月 【摘要】：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 超氧化物歧化酶广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属酶类。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子（O2）是人体氧代谢产物，它在体内过多积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 【关键词】：超氧化物歧化酶，酶活力，同工酶类型 【前言】：超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, )，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。 SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用的一种物质），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。植物中芦荟的SOD含量丰富，所以，本实验研究中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。 本综合性实验包括如何提取纯化一种酶，研究pH、温度和不同的离子对酶活性的影响，测定酶的最适pH、最适温度，并通过不连续电泳法来判断该酶的同工酶类型。 【材料】：芦荟、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.mol/L）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮邻苯三酚、浓盐酸A、B、C、D、E、F、G贮备液（棕色瓶装，4℃保存）。 贮备液 名称 试剂 A 分离胶缓冲液 B 浓缩胶缓冲液 C 分离胶贮液 D 浓缩胶贮液 E 核黄素 F 蔗 糖 G 过硫酸胺 1mol/L HCl 48mL 48mL Tris 36.6g 5.98g TEMED 0.23mL 0.46mL Acr 28g 10g Bis 0.735g 2.5g 核黄素 4mg 蔗糖 40g 过硫酸胺（AR） 0.14g 加重蒸水至 100mL 100mL 100mL 100mL 100mL 100mL 100mL 说明 调节8.9 调节6.7 现配现用 现配现用 染色液：2.45mol/L NBT：称取200mgNBT溶于蒸馏水中并定容至100ml置棕色试剂瓶中，避光贮存，以免氧化变质。 脱色液：3.60mol/L PH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/L TEMED和2.8g维生素）：在100ml 3.60mol/LPH7.8 磷酸钠缓冲液中加0.42mlTEMED及1.32mg维生素 ，置于棕色瓶中贮存 Ｔris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)：Ｔris 6.0g, 甘氨酸28.8g，加蒸馏水溶解，再定容至1000mL，置试剂瓶中，4℃贮存，临用前稀释10倍。 0.01％溴酚蓝溶液 测试样品： ①PH7.8磷酸缓冲液+0.1ml酶液 ②CHCl3-CH3CH2OH+0.1ml酶液 ③H2O2+0.1ml酶液 1%琼脂（糖）溶液：琼脂（糖）1g，加已稀释10倍的电极缓冲液，加热溶解,4℃贮存。 【实验步骤】 一．SOD的提取与初步纯化 1.配制缓冲溶液——磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2mol/L） 配制0.2mol/L NaHPO溶液，1L需NaHPO固体0.2×（23×2+1+31+16×4）=28.4g，在大烧杯中溶解后，加入1000ml容量瓶中定容。 配制0.2mol/L NaHPO溶液，1L需NaHPO固体0.2×（23+2+31+16×4）=24g，在大烧杯中溶解后，加入1000ml容量瓶中定容。 将芦荟洗净，