生物化学综合实验报告(毛豆总蛋白质的提取及亲缘关系的研究).docx

生物化学综合实验毛豆总蛋白质的提取及亲缘关系的研究姓名：学号:201064学院：生物与食品工程学院班级：食品科学与工程10-2班毛豆不同组织可溶性蛋白提取和多肽组分差异研究摘 要：本实验对毛豆的子叶与豆荚中可溶性蛋白进行提取，用考马斯亮蓝法对其定量分析，并采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳分离且比较其中的多肽组分，掌握蛋白质的一般研究方法和操作，而且对毛豆的不同组织的可溶性蛋白的性质有所了解。关键词：毛豆 可溶性蛋白 考马斯亮蓝 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Abstract:The experiments of soybean cotyledon and its rind of soluble protein extraction, with Coomassie Brilliant Blue to test its quantitative analysis, and even a SDS polyacerylamide gel electrophoresis separation and is one of the protein components, polypeptide of the general method ,and operation of sweet potatoes, and the organization of the protein in nature have been resolved.Keywords:soybean solution protein Coomassie Brilliant Blue SDS引言蛋白质的性质、结构和功能的研究，以及生物体内蛋白质构象的变化都是建立在蛋白质分离纯化基础上的。在蛋白质的分离过程中，必须通过分子量大小测定来获得所提蛋白质的大小，并通过SDS电泳比较分析有差异的条带。毛豆，就是新鲜连荚的黄豆，晒干之后又称大豆。毛豆中富含不饱和脂肪酸、卵磷脂、食物纤维、金属离子钾和铁，另外还有降血脂和降低血液中胆固醇的作用和养颜润肤、有效改善食欲不振与全身倦怠的功效。本实验通过对毛豆不同组织可溶性蛋白的提取，含量测定，差异条带研究，从而掌握蛋白质的系列研究方法和操作。目 的1.掌握冷冻离心机的操作使用方法；2. 掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理；3.掌握分光光度计的使用方法和原理；4. 掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理；5. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。原 理植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。考马斯亮蓝 G-250（Coomassie brilliant blue，G-250）法是利用蛋白质 -染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm，通过测定 595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比Lowry 法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitamin B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。使用不连续凝胶电泳因具有浓缩效应而能得到较好的电泳条带。（分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子