啤酒酵母蔗糖酶提取分离纯化性质鉴定及反应动力学实验.docVIP

3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作 葡萄糖含 量（mg） 0.00 0.4 0.8 1.2 2.0 2.8 3.6 4.0 A540 0.000 0.058 0.162 0.261 0.437 0.603 0.737 0.868 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作 标准液蛋白质浓度（μg/ml） 0.00 4.17 8.33 16.67 25.00 33.33 41.67 A650 0.000 0.098 0.169 0.339 0.451 0.592 0.704 米氏常数 1/A 4.876 3.985 3.370 2.831 2.460 2.032 1.831 1/S 100.0 80.0 66.7 50.0 40.0 26.7 20.0 正交实验结果分析： 啤酒酵母蔗糖酶提取、 分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验 一、实验目的 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 二、实验原理 1、蔗糖酶的提取 细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的酵母菌细胞破壁方法有机械（匀浆）法、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法、溶胞作用 (酶溶解法)、自溶法，本实验采用自溶法。 自溶法即将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2、蔗糖酶的纯化 （1） 酶的蛋白属性 ① 两性电离： 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 ② 等电点 (isoelectric point, pI) ：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。 ③ 大分子(胶体) : 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达 1～100nm，为胶粒范围之内。 ④ 稳定的因素: 颗粒表面电荷、水化膜 （2）调节酶溶解度的方法； ① 改变离子强度；盐析、硫酸铵分级沉淀 （反抽提法） 反抽提法（Back Extraction） 例：E.coli RNA聚合酶 42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀 通常方法：先 33%-------再 50% 反抽提法：再 42% 将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性。 ② 改变pH或温度；酶在未纯化之前 pI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在 70 oC，10 min ③ 改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制：常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5-2% 为好。 （3）根据酶分子大小、形状不同的分离方法 离子交换层析：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换分离的基本步骤---平衡-上样-吸附-洗脱-再生。选择离子交换介质时应注意对pI=5的某酸性蛋白质，当蛋白质为阴离子时在 pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂；当蛋白质为阳离子时，在 pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂。本实验我们选用DEAE-52 离子交换层析。 3、各纯化级别蔗糖酶的活力测定 酶活力 (enzyme activity)：酶催化某一反应的能力，位时间内单位体积中底物 (substrate) 的减少量