是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小rna 分子, 长度为18.pptVIP

生物芯片检测细胞中microRNA 的表达 MicroRNA Expression in Cells Detected by Oligonucleotide Microarray 1 材料和方法 * * * 07生技1 microRNA(miRNA) 是一类在线虫、植物、昆虫和哺乳动物中存在的小RNA 分子, 长度为18- 26 个核苷酸( nt) 的小非编码RNA，类似于siRNA的分子 。 miRNA 通过调节基因表达, 参与调控细胞的众多生物学功能, 如生物发育、脂肪代谢, 及细胞的分化、增殖和凋亡等。它们通过与靶mRNA 的3 非翻译区( 3 - UTR) 互补, 将mRNA 剪切或是抑制其翻译。 人类基因组中已发现300 多种miRNA, 而且预测实际数目会更多, 它们可能会对人类基因组中近30%的基因发挥调控作用。但关于miRNA 的表达模式、生物学功能、作用机制等, 目前的认识还不很清楚。在此, 我们设计并制备了miRNA 表达谱的寡核苷酸芯片, 利用其快速、平行、高通量的检测特点, 分析了6 种不同细胞系中206 个miRNA 的表达水平特点, 为miRNA 的进一步研究奠定了基础。 1.1 材料 实验所用6 种人类肿瘤细胞系均为本实验室保存, 分别HeLa( 人宫颈癌上皮细胞) 、K562( 人慢性髓细胞性白血病细胞) 、ES- 2( 人卵巢透明细胞癌) 、MCF- 7( 人乳腺癌细胞) 、HT- 29( 人结肠腺癌细胞) 和A549 细胞( 人肺腺癌细胞) 。所有细胞系均在5% CO2 条件下, 用含有10%胎牛血清的适合培养基培养。 1.2 miRNA 芯片的制备 所用的210 个寡核苷酸探针为mirVanaTM miRNA Probe Set试剂盒(Ambion) , 其中206 个与已知的人类和小鼠miRNA 序列互补, 4 个为阳性对照。3×SSC 点样缓冲液溶解探针至50 μmol /L, 用SpotArrayTM 24 基因芯片点样仪( Perkin Elmer) 印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer) 玻片表面, 制成miRNA 寡核苷酸芯片。每次杂交前进行水合、干燥等点样后处理。 1.3 miRNA 的准备、标记与杂交 依mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion) 说明书提取肿瘤细胞的富集miRNA。用Universal Microplate Spectrophotometer(Bio- tek) 紫外分析仪测定miRNA 浓度和纯度, 8 mol /L 尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶检测质量。依mirVanaTMmiRNALabeling Kit(Ambion) 说明书对富集miRNA 进行荧光标记, 方法简单描述如下: 先在miRNA 末端添加20- 50 个经过氨基修饰的核苷酸尾, 然后与带有N- 羟基琥珀酰亚胺酯类(Nhydroxysuccinimidylester, NHS- ester) 的荧光染料Cy3 (Amersham Biosciences)反应。标记后的样本与3×miRNA Hybridization Buffer(Ambion) 混合并将其均匀铺于miRNA 寡核苷酸芯片表面, 小心加盖玻片封片, 置于密封湿润的杂交仓中, 42℃杂交16 h。最后进行杂交后清洗。 1.4 芯片图像的采集与数据处理 采用ScanArrayTM Express1.0 ( Perkin Elmer) 扫描仪进行扫描, 扫描强度为100%, 光电倍增管增益为80%, 扫描精度为10μm。扫描所得图ScanArray3.0( Perkin Elmer) 软件进行处理, 得到杂交信号和与之相应背景的平均强度值, 从杂交信号值中减去背景值得到校正信号强度值。6 种细胞检测所得数据经阳性对照均衡后比较。判断表达存在差异的标准是: ①相互比较的miRNA 信号荧光强度值相差至少大于1 000; ②若其中有信号强度值小于100, 则同一种miRNA 在不同细胞的荧光值差异需大于500。数据经总体归一化和对数转化后, Cluster3.0( Stanford University) 进行聚类分析。 1.5 RT- PCR 验证miRNA 分别取6 种细胞总RNA 各5 μg, 用与miR- 17- 5p、miR- 21前体互补的特异性引物和逆转录酶SuperscriptⅢ ( Invitrogen) 进行逆转录反应, 分别取1 μL 逆转录产物进行PCR 反应中的miRNA 序列设计特异性引物,有关参数见表1。用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶验证扩增产