紫花苜蓿ISSR—PCR反应体系的建立与优化.PDFVIP

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2017-09-04 发布于河北
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紫花苜蓿ISSR—PCR反应体系的建立与优化.PDF

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紫花苜蓿ISSR—PCR反应体系的建立与优化

维普资讯第 15卷第3期草地学报 2007正 5月 Vo1．15 No．3 ACTA AGRESTIA SINICA Mav 2007 文章编号：1007—0435(2007)03—0212-04 紫花苜蓿ISSR—PCR反应体系的建立与优化王瑜，袁庆华 (中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094) 摘要：通过优化影响紫花苜蓿 (MedicagosativaL．)ISSR—PCR的主要参数，建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在2O L体系中各反应物的最适含量为：15ng模板DNA，0．2mmol／LdNTP，0．4~mol／LISSR引物， 0．8UTaqDNA聚合酶，2 L10×PCRBuffer，1．5mmol／LMgC12，2．5 去离子甲酰胺。PCR扩增程序为：94℃ 预变性4min，94℃变性30s，62℃(62℃～58℃)退火45s，72℃延伸 1min45s，共 11个循环，每个循环退火温度降 1℃；94℃变性 30s，52℃(52℃～48℃)退火45s，72℃延伸1min45s，共24个循环；72。C延伸5min，25℃保温。关键词：紫花苜蓿；ISSR；PCR反应体系；优化中图分类号：S812；Q943 文献类型：A EstablishmentandOptim izationofISSR ReactionSystem forAlfalfa W ANG Yu，YUAN Qing—hua (InstituteofAnimalSciences，ChinseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100094，China) Abstract：Alfalfa(Medicagosativa．L．)wassubjectedtoISSR (Inter—simplesequencerepeats)一PCR to investigate the genetic diversity and the specificmolecularmarkers linked to specific characters． By studyingthemainparametersweestablishedtheoptimalISSR—PCR reactionconditionsinalfalfa．Results show thattheoptimum concentrationsofsevenreactantsin 20 L reactionmixtureareasfollows：15ng genomicDNA，O．2mmolL dNTP，O．4 ~／molL_。ISSR primer，0．8U TaqDNA Polymerase，2 L 1O× PCR Buffer，1．5mmolL_。MgC12，2．5 deionized formamide．The suitable PCR procedure isone preliminarydenaturationat94℃ for4min；11cycleseachinvolveddenaturationat94℃ for3OS，annealat 62℃ (62℃～ 58C)for45S，with1℃ declinedeachcycle，extendedat72。C for1min45S；thenfollowed by24cycleseachwithdenaturationat94℃ for3OS，annealat52℃ for45S，extendedat72_C for1min45 S：andafinalextensionat72℃ for5min，thenkeepthetemperatureat25℃ ． Keywo