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京尼平交联脱细胞牛心包生物支架材料实验探究[摘要] 目的:初步探讨新型生物交联剂京尼平对脱细胞牛心包基质作为支架材料的影响及意义,为心肌组织工程心脏补片的构建提供较理想的生物支架材料。方法:实验分为三组,A组(25块)为新鲜未脱牛心包组织,B组(25块)为脱细胞牛心包组织,C组(25块)为京尼平交联的脱细胞牛心包组织。采用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;以组织厚度、热皱缩温度和抗拉力测试观察基质的物理性能变化。结果:光学显微镜、扫描电镜观察显示去污剂-酶消化法去细胞百分率达98.63%,能够有效脱除细胞,完整保留牛心包组织的胶原纤维和弹力纤维;组织厚度测试结果为,A组(3.8±1.0) mm,B组(3.8±1.2) mm,C组(4.0±1.0) mm;组织热皱缩温度测定结果为,A组(78.50±0.50)℃,B组(67.90±0.60)℃,C组(85.90±0.40)℃;组织抗拉力测试结果显示,经交联剂京尼平处理后C组最大载荷、最大应力、弹性模量、最大应变均高于A组,差异有统计学意义(P 1.2 新鲜牛心包的处理 从养牛场采集新鲜成年牛心包,冰盐水保存运输,3～6 h后剔除心包表面残留的脂肪及其他结缔组织,然后4℃ D-Hanks液漂洗,随机分成三组:A组(25块)为新鲜未脱牛心包组织,B组(25块)为脱细胞牛心包组织,C组(25块)为京尼平交联的脱细胞牛心包组织;然后对B组(25块)和C组(25块)采用去污剂-酶消化法处理获得脱细胞牛心包组织。 1.3 脱细胞支架材料的实验方法 ①将B组(25块)和C组(25块)牛心包浸入4℃、pH 8.0且含0.05 mol/L NaCl、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。②浸入4℃、pH 8.0且含1.5 mol/L NaCl、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。③4℃,pH 7.4,D-Hanks液清洗。④用4℃、pH 7.4且含1% Triton X-100、0.02% EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的Tris-HCl浸泡24 h。⑤4℃、pH 7.4、不含Mg2+、Ca2+的D-Hanks液清洗。⑥37℃、pH 7.6、含DNAaseⅠ(10 mg/L)、RNAaseA(1 mg/L)、Mg2+(3 mmol/L)、Ca2+(1 mmol/L)的10 mmol/L Tris-HCl消化1～2 h。⑦4℃、pH 7.4、含1% Triton X-100的Tris-HCl浸泡24 h。⑧4℃、pH 7.4 D-Hanks液浸泡48 h。 1.4 京尼平交联脱细胞牛心包组织 C组(25块)采用含碘溶液[2]于37℃孵箱内作用48 h予以消毒,然后在37℃用0.625%京尼平溶液交联脱细胞的新鲜牛心包组织72 h[3],磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗备用。 1.5 检测项目 1.5.1组织学观察将A组、B组牛心包组织各5条置入10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋、切片、HE染色后在显微镜下进行组织学观察和扫描电镜观察。去细胞百分率=(新鲜牛心包组细胞总数-去细胞组残留细胞数)/新鲜牛心包组细胞总数。 1.5.2 厚度、组织热皱缩温度测定A组、B组和C组牛心包组织各取10片,裁成40 mm×5 mm试条,以蒸馏水为介质,从室温开始,每分钟升高2℃,应用热收缩温度测定仪和HD-10型厚度仪(精度0.01 mm)完成测试。 1.5.3机械力学测试将A、B、C组牛心包组织剪成5.0 cm×1.0 cm矩形条块各10条,两边夹于材料性能试验机(INSRON 5544材料性能试验机,太原理工大学生物力学实验室),夹持间距为15 mm。以10 mm/min将管道壁组织向两边拉伸,记录最大载荷、最大应力、最大应变和弹性模量。 1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,数据用均数±标准差(x±s)表示,组间两两比较采用t检验分析,三组间比较采用单因素方差分析,P0.05);热皱缩温度测定结果显示,C组分别与A组和B组比较,热皱缩温度差异有统计学意义(P 京尼平是从栀子果实中提取的天然交联剂,它是一种环烯醚萜类化合物, 具有羟基、羧基等多个活性官能团。京尼平克服了常见交联剂在处理生物组织方面的缺点,无细胞毒性,而且由其交联的生物组织在移植后不易钙化[10-11]。其可能的交联机制如下:首先自发与氨基酸残基的自由氨基反应生成一个环烯醚萜的氮化物,随后经过脱水作用形成一个芳香族的单体,之后这一芳香族单体可能由于自由基反应的二聚作用而形