ellman测巯基.docVIP

Ellmans Reagent ,埃尔曼的试剂 ，5,5二硫代双 - （二硝基苯甲酸），5克 Molecular Weight: 396.35 分子量：396.35 CAS #: 69-78-3 CAS号：69-78-3 使用半胱氨酸标准精确量化巯基程序 材料的制备 (反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA 半胱氨酸： 3 Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解程序 反应缓冲液1.的半胱氨酸 Standard Volume of Reaction Buffer Amount of Cysteine (M.W. = 136.2) Final Concentration A 100 ml 20.43 mg 1.5 mM B 5 ml 25 ml of Standard A 1.25 mM C 10 ml 20 ml of Standard A 1.0 mM D 15 ml 15 ml of Standard A 0.75 mM E 20 ml 10 ml of Standard A 0.5 mM F 25 ml 5 ml of Standard A 0.25 mM G 30 ml 0 ml 0.0 mM (Blank) 2 取若干试管，每50μLEllman试剂和2.5mL的反应缓冲液。 3250μL各浓度的标准或注：对于未知的稀释，以便使标准曲线工作范围（理想的浓度0.1-1.0）。 4在室温混合和15分钟。 5 在412 nm处测量吸光度。 6.数值生成一个标准曲线 摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的 材料的制备 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解B.测量吸光度 1.，管50μL的Ellman试剂溶液和2.5mL反应缓冲液。 2.250μL待测样品,，空白添加250μL反应缓冲液Note : 尽量使待测样品的浓度小于1.0mM，浓度太高将会导致误差变大 3.在室温混合和15分钟。 4.分光光度计412吸光度。 5.的摩尔消光系数14,150)计算巯基含量 The TNB dianion has a relatively intense absorbance at 412nm compared to该国能在412nm的合成，有一个相对比较激烈的吸光度 both disulfides.同时二硫化物。 Because the stoichiometry of protein thiol to TNB formed由于蛋白质的巯基，以国能形成化学计量 is 1:1, TNB formation can be used to assess the number of thiols present.为1:1，国能形成可以用来评估硫醇数目。 In the absence of denaturants, only accessible thiols will react, whereas在变性剂的情况下，唯一能够找到的硫醇的反应，而 in the presence of chaotropic agents the total number of reduced Cys residues残留的chaotropic代理人在场的总数减少胱氨酸 present can be measured.目前可以衡量的。 Reduction of the protein followed by treatment经处理后减少的蛋白质 with chaotropes and DTNB can yield the total number of cysteines (Cys-SH与chaotropes及DTNB能够产生的半胱氨酸总数（半胱氨酸巯基 plus Cys-SS-Cys).加半胱氨酸-β-半胱氨酸）。 - - - - The reaction is sensitive to alkaline pH ( OH) competes with RS ),反应是敏感的碱性pH值（俄亥俄州）与RS竞争）， acidic pH (disulfides can be broken), oxygen (reoxidation of R-SH), and酸性pH值（二硫化物可以打破），氧（R的巯基再氧化），以及 temperature (thermochromism).温度（热致变色）。 Conse