第二章动物组织及细胞培养.pptVIP

2、组织消化法--借助酶和螯合剂处理组织，使其成为分散的细胞。 1）胶原酶解离细胞法 对解离胚胎性、正常和恶性成体组织有效。 2）胰蛋白酶解离细胞法 有热（370C）和冷（40C）两种处理。主要缺点是破损细胞。冷处理有利于获得较多的活细胞，而热处理则需时间较短，所以热处理法更为广泛采用． 3）螯合剂解离细胞法 柠檬酸钠，乙二胺四乙酸钠。将EDTA配在缺Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液内，可用来分散鸡胚细胞。这种方法分离效果差，不易从培养液中去除 3、离心方法---体液和渗出液中的细胞群体，则采用离心等方法收集或浓缩。 1、组织块接种培养 特点 直接切割分离的组织块，在一定程度上保持了原有的组织结构，对于初期体外培养的环境适应性比直接分离成单细胞要强。 基本方法 首先将组织剪切成碎块后，用平衡盐溶液漂洗；然后在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等，再将其切成1mm3大小；再用平衡盐溶液漂洗2-3次，然后将其转移到培养瓶内培养， 方法 将解离消化获得的细胞沉淀，根据实验要求，用培养液配制成需要的细胞悬液，然后接种到培养瓶内，水平放置，37℃下静止培养。每隔1-2天换培养液一次，培养一定时间后，细胞在培养瓶底即形成一单细胞层。 4、细胞培养中应注意的要点 1）培养液和培养物 一定浓度的营养液仅能支持一定数量的细胞的生长，不能盲目的增加每单位体积的细胞浓度。细胞生长后，营养物被细胞耗尽，氨基酸浓度下降，细胞内代谢水平难以维持，营养物变成限制生长的因素。 培养液中的葡萄糖是另一个生长限制因子。 2）培养pH 培养起始的pH为7.4最合适，培养过程中pH不能低于7.0，当pH低于6.8时，对细胞生长会有抑制作用。 影响培养液pH稳定的因子：缓冲液缓冲效力和类型，培养瓶内的空间，以及葡萄糖的浓度。 3)培养瓶内的空间 一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10,为了能给处在3-6mm厚的培养液下的细胞生长提供足够的氧气，必须不断地提供氧气到培养液内。所以在一个密闭培养系统内保持留有足够贮放空气的空间。 4）容积、深度、表面面积 培养液体积与表面面积的正常比例为0.2-0.5ml/cm2。 当悬浮培养液的深度增加时，必须用磁力搅拌器搅拌。为防止搅拌过程产生泡沫，搅拌培养的培养液必须以5cm为最低限度。培养液介于5mm和5cm之间的深度，可使用旋转瓶来培养。 5）可活与不可活细胞的分开 当从分散的细胞制备原代培养物时，存在于细胞悬液中的无活力细胞可在第一次换培养液时除去。 （2）传代培养的方法 主要有： 1）贴壁培养 用于单层细胞培养 2）悬浮培养 用于非贴壁细胞培养 * 第二章 动物组织及细胞培养  动物细胞培养过程 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 细胞悬浮液 胰蛋白酶 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。 （分解弹性纤维） 10代细胞 原代培养 50代细胞 传代培养 细胞株 无限传代 连续细胞系 遗传物质未改变 遗传物质改变 接触抑制 原代细胞培养 细胞系的建立和细胞克隆 原则上，各种动物组织都可进行培养，但培养容易程度，一般幼龄组织》老龄， 分化程度低》高 肿瘤组织》正常组织 任何动物细胞培养均需从原代培养开始 第一节、原代细胞培养 一、组织及细胞解离 二、细胞原代培养方式 一、解离组织方法： 1、机械方法---用剪刀镊子剖取组织和器官，加以修整，必要时切成小块； 机械解离细胞法 有些软组织如胚胎肝、胚胎或成年的脑组织、软肿瘤组织，比酶法所需时间短，但细胞存活率比较低。 切割 挤压 过滤 记数 二、细胞原代培养方法 1、组织块接种培养 2、单层细胞培养(组织消化培养) 3、悬浮细胞培养 2、单层细胞培养(组织消化培养) 特点 1、更换培养基容易 2、便于观察不同条件对细胞生长的影响，从而灵活调节培养条件； 3、培养后期容易使用灌注技术改善营养条件； 4、细胞贴附于基底质上，更容易表达产物。 3、悬浮细胞培养 适用细胞 具有非贴壁特性的细胞，如血细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。 基本方法 培养方法与植物细胞的悬浮培养相似，即在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬液。 接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间在24-48小时的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，倍增时间在12-18小时的细胞类型接种密度以2×104/ml为宜。 第二节.细胞系的建立与细胞克隆 细胞系建立 细胞克隆 传代培养 一、传代培养 1、传代培养的确立 当组织块的生长晕不断扩展到一定大小，营养缺乏； 细胞生长停止，出现脂肪滴； 组织