免疫组化预测肝纤维化继发肝肿瘤潜在危险性之价值.docVIP

免疫组化预测肝纤维化继发肝肿瘤潜在危险性之价值摘 要 目的：采用免疫组化技术检测肝纤维化组织标本中PCNA和C-erbB-2预测肿瘤的发生等生物学行为，预测并分析肝纤维化继发肝肿瘤的危险性。方法：四氯化碳复合法制备肝纤维化模型，对纤维化肝组织进行病理分期，并用免疫组织化学方法检测纤维化肝组织内细胞增殖相关因子增殖细胞核抗原PCNA、癌基因C-erbB-2的表达。结果：研究表明，各实验组间PCNA、C-erbB-2阳性表达数随病理分期而增加，组间比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：肝纤维化存在肝细胞异常增生及基因突变，在此基础上有肝恶性肿瘤发生之潜在危险性。 关键词 肝纤维化 肝肿瘤 病理检查 免疫组化 资料与方法 肝纤维化模型准备：①实验动物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠，购自包头医学院实验动物中心。②实验试剂：四氯化碳，上海化学试剂厂生产；99.9%分析纯；10%乙醇，上海化学试剂厂生产。 四氯化碳复合肝纤维化模型制备方法：健康清洁级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠（购自包头医学院实验动物中心）38只，体重150～220g，平均180g，随机分5组，根据文献报道方法采用复合因子致肝纤维化模型方法，建立鼠肝纤维化模型。 造模方法：①以79.5%纯玉米粉加20%猪油、0.5%胆固醇制成低蛋白高脂肪高胆固醇混合饲料喂饲实验大鼠；②以10%乙醇为惟一饮用水喂饲实验大鼠；③第1次皮下注射40%四氯化碳石蜡油液0.5ml/100g，以后每隔3天0.3ml/100g重复皮下注射，为期6周。 各期造模结束后处死实验动物，取肝组织以10%甲醛固定，标本大小约1cm×1cm×1cm。常规石蜡连续切片，分别进行苏木精-伊红（HE）及Masson三色染色进行病理观察。 染色结果：Masson染色胶原纤维呈蓝绿色，细胞核呈蓝黑色。HE染色细胞浆、结缔组织等呈不同程度的红色。采用2000年［１］西安全国会议通过的纤维化分期分类标准（S 0～4），至少在光学显微镜下显示包括6个以上汇管区，由两位有经验的病理科医生分别观察做出最终纤维化诊断。 纤维化程度分期诊断标准为：①S0期：无纤维化；②S1期：汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；③S2期：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；④S3期：小叶间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；⑤S4期：早期肝硬化。 免疫组织化学：用免疫组织化学方法检测肝组织内细胞增殖相关因子增殖细胞核抗原PCNA、癌基因C-erbB-2的表达。 材料：①鼠抗人PCNA及C-erbB-2单克隆抗体，武汉博士德生物公司提供。②羊抗鼠IgG，美国Sigma公司提供。③SABC免疫组化检测试剂盒，武汉博士德生物公司提供。 方法步骤：①4μm厚的石蜡切片于APES处理过的载玻片上，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS液冲洗1次。②采用微波修复法修复约20分钟，PBS液冲洗3分钟3次。③室温下，新鲜配制0.3%的过氧化氢-甲醇液阻断剂，浸泡切片10分钟，以阻断内源性过氧化酶的活性，取出后PBS液振洗5分钟×3次。④滴加复合消化液，37℃培育20分钟，充分暴露组织抗原。滴加10%正常鼠血清10分钟封闭非特异性抗原。室温下封闭10分钟,甩去多余液体，不洗。⑤分别滴加适当稀释的一抗，4℃湿盒孵育16小时，37℃复温1小时。取出后PBS液振洗5分钟×3次。⑥滴加生物素标记的二抗（鼠抗鼠IgG）,37℃湿盒内反应20分钟。取出后PBS振洗3分钟×3次。⑦滴加SABC复合物溶液（链霉素抗生素-过氧化酶），37℃湿盒内反应20分钟。取出后PBS振洗5分钟×4次。⑧苏木精复染，盐酸酒精分化数秒，氨水返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察结果。 实验对照：阳性对照由博士德生物工程有限公司提供阳性对照片，染色后均呈阳性。在免疫组化步骤中，以PBS液代替一抗作阴性对照，结果均为阴性。 阳性判定标准：PCNA阳性为胞核染色呈棕黄色，高倍镜下观察呈颗粒状。以空白切片为标准对照，高倍镜下（×400）随机选取10个视野，选择阳性细胞区域计数，根据计数多少判断PCNA表达量，计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，视野中PCNA阳性肝细胞数/1000×100%为PCNA阳性细胞标记指数（LI）计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，＞25%为（?），25%～50%为（??），50%～75%为（???），＞75%为（????）；C-erbB-2阳性为胞膜染色呈棕黄色，高倍镜下观察呈颗粒状，以空白切片为标准对照，高倍镜下（×400）随机选取10个视野，选择阳性细胞区域计数，根据计数多少判断C-erbB-2表达量，计数高倍视野1000个细胞中的着色细胞，视野中