体外诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化初步探究.docVIP

体外诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化初步探究[摘要]目的：探讨人脐带血间充质干细胞存在及体外向成软骨细胞分化的可能性。方法：将无菌条件下采集健康产妇脐带血，用相对密度为1.077g/m1的人淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，利用间充质干细胞贴壁生长的特性获得MSCs，流式细胞仪检测其表面抗原标志。联合应用TGF－β1和IGF－Ⅰ及含有1×ITS+I的高糖DMEM进行诱导培养，并于诱导前及诱导后第21天留取细胞，甲苯胺蓝染色，免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达，分析是否诱导出成软骨细胞。结果：脐血MSC强表达CD44、CD105，不表达CD34、CD45。诱导21天甲苯胺蓝染色阳性，特异性表达Ⅱ型胶原。结论：人足月脐带血中存在MSCs，在TGF-β1等生长因子诱导下可以向具有软骨细胞表型和功能的细胞分化。 [关键词]脐带血；间充质干细胞；成软骨细胞；转化生长因子-β1 [中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)04-0450-05 脐带血(human umbilical cord blood，HUCB)作为造血干细胞的来源，能够替代骨髓移植来治疗多种疾病，但是在脐血中是否含有间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)仍存在争议。其中间充质成分的鉴定仍然不明。为此，本实验探讨其存在可能性及向软骨分化的潜能。 1　材料 1．1　标本：在无菌条件下采集于健康育龄产妇足月自然分娩的脐带血40－60ml。经检测均未发现急慢性传染性疾病和感染性疾病，无家族性疾病，新生儿无畸形。所采集样本肝素抗凝(25U/m1)。 1．2　试剂：α－MEM、FBS及高糖DMEM(Gibco公司)、人淋巴细胞分离液(天津TBD)、鼠抗人CD34－FITC、CD44-FITC、CD45－FITC、CDl05－PE(BD公司)、TGF－β1、IGF―I(Peprotech公司)、ITS+1(Sigma公司)、鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体(福州迈新)、SP奥抗试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中衫) 1．3 耗材和仪器：培养板、培养瓶(Corning)、流式细胞仪(BD公司)、相差倒置显微镜(Olympus) 2　方法 2．1　脐血单个核细胞的分离、培养：将所采集脐血样本于12h内处理。用D―Hanks缓冲液1:1等比稀释，再与37℃预温的3％明胶等比混合，室温下静置至血浆与红细胞界面形成后，吸取血浆层，离心，收集细胞；用5mlα-MEM重悬所得细胞，按2：1的体积比加到人淋巴细胞分离液(1.077g/m1)表面，离心后吸取悬于分离液面的白膜层，获得单个核细胞。D―Hanks缓冲液洗涤2次，加入α―MEM(含20％FBS、IOOU/ml青霉素、100U/ml链霉素)培养基，吹打均匀制成单细胞悬液，计数，以1×106cells/ml浓度接种于一次性塑料培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。4天后首次换液，去除未贴壁的细胞，以后每隔3天换液一次。在相差倒置显微镜下观察细胞生长情况。细胞生长至60％时，用0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA消化，1：1传代。第一代后细胞生长达到80％-90％时，按1：3传代。 2．2 脐血MSCs生物学特性检测 2．2．1 脐血问充质干细胞的冻存和复苏：将生长情况良好的P3代细胞用消化液消化成单细胞悬液，洗涤，离心，收集细胞沉淀，用含有10％DMSO的冻存液重悬细胞，调细胞密度至5×106/ml。无菌的冻存管分装，封口。置于70℃冰箱中，3h后，取出冻存管移入液氮容器内。复苏：细胞冻存3个月后，将冻存管从液氮中取出，迅速放入40℃的水浴中，摇动，1-2min内解冻，复苏，洗涤后，加入新鲜的培养液，调整细胞浓度，接种，置37℃恒温培养箱中培养。 2．2．2 脐血MSCs生长曲线的检测：接种细胞分为两组：①冻存组：同一样本来源的冻存细胞；②对照组：取生长良好的P3细胞。调节细胞浓度，以1×104cells/ml浓度，接种于24孔培养板中，每孔1.0ml，24h后换液，去除未贴壁的细胞。每天取6孔消化，每孔计数3次，求均值。连续8天。未测者应及时换液。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘生长曲线。并定期观察细胞生长情况，包括形态特点，细胞到达平台期即停止观察。 2．3 脐血MSCs表面抗原的检测：取生长状态良好的P3代细胞，在细胞达到80-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA的消化液消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106ells/ml。分别加入鼠抗人CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE单克隆抗体，阴性对