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生化技术 广州中医药大学 生物化学教研室 吴映雅 1定义 生化技术——在生物化学及其相关学科应用的各种技术，主要指生物体内物质及其代谢产物，特别是生物大分子的分离、检测、制备与改造技术。 2发展过程 1923 Svedberg设计超速离心机 1925 Warberg发明微量检压仪 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用 1931 Kuhn柱层析分离α、β-胡萝卜素 1940 电泳、层析技术 50-52 气相色谱（GC） 1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构 1953 Watson、Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构 1960 操纵子学说 1964 人工合成胰岛素 1969 固定化酶、细胞技术 1973 基因工程 1975 细胞工程（杂交瘤技术） 1990 启动人类基因组计划 生化与分子生物学技术在解决生命医学问题中的基本任务 在某种生物表型、生理状态或病理状态下，是否特异性地产生基因（或蛋白）X ？或者，基因（蛋白）X的生成量是否发生特异性的改变？ 将基因（蛋白）X从研究对象（细胞、组织、器官、实验动物、人体）中剔除，该生物表型、生理状态、病理状态能否得到逆转（或加重）？ 将基因（蛋白）X重新导入研究对象，或增加其生成量，能否重现（或减轻）该生物表型、生理状态、病理状态？ 生物大分子的分离、纯化与制备 –离心技术 –电泳技术 –层析技术 –透析技术 –超滤技术 –外源基因表达（原核或真核） ?生物大分子的定性研究 –PCR与RT-PCR –DNA测序 –蛋白质组学技术 生物大分子的定量与半定量研究 –紫外分光 –定量PCR –免疫印迹分析（Western blot） –定量电泳 –Southern blot 与Northern blot ?基因与蛋白的功能确认 –基因转导 –基因剔除 –转基因 –RNAi技术 –蛋白质组学技术 一、电泳技术 电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Re?ss进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年以后. 1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 电泳的分类 原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 按采用介质的不同分类 淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。 电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 电泳的基本原理 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 V:泳动速度cm/秒or分 d:泳动距离cm t:电泳时间 (秒/分) E:电场强度 伏特/cm 带电粒子在电场中的移动与: 粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快 粒子的电荷有关，电荷愈多愈快