第二章-基因工程制药-新版3.pptVIP

目的DNA可来自 直接从组织中提取 B. 基因文库 cDNA文库 D. PCR扩增 E. DNA合成仪合成 目的DNA与载体的连接方法可有 粘性末端连接 B. 平头末端连接 同源多聚尾连接 D. 人工接头法 E. 载体分子的自身环化连接 差异显示技术 利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过比较正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因或沉默基因，从而推测可能是癌基因或抑癌基因。 差异展示PCR法（DD-PCR) 原理：将具有两组细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的DNA。通过变性聚丙烯酰胺电泳，检测差异条带。 构建cDNA文库 依据表达序列标签EST，设计引物用PCR技术扩增基因组中特异片段。 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 DNA连接----目的基因DNA片段与载体DNA，在DNA连接酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组DNA分子的过程，称为DNA的连接。 粘接法----具有互补粘性末端的目的基因，与载体DNA，在DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为粘结法。具体有插入灭活法、定向克隆法、载体脱磷克隆法、同聚接尾法、双接头法、合成连接一步法。 平接法----具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间，在T4-DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为平结法。 下面具体讲解6种方法。 （一）、插入灭活法 1、定义与方法 2、例子 3、优缺点 1、定义与方法 定义----将外源性基因插入到载体的选择性基因区域（标记区域）、并使这一选择性标记区域失活的连接法，称为插入灭活法。 方法----将外源性DNA与质粒用同一限制酶消化，并且限制酶的切割位点是在标记基因区域，当目的基因插入标记区域时，就使得标记基因失去表达作用。 2、例子 插入失活蓝白斑筛选技术 根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入重组子的菌落显蓝色。 3、优缺点 优点----比较简单，容易操作。 缺点----杂合重组率低，在重组的产物中除了产生同时嵌合体重组DNA之外，还混有（1）pBR322环合DNA、（2）目的基因环合DNA、（3）pBR322线性DNA、（4）目的基因线性DNA。 （二）、定向克隆法 1、定义与方法 2、连接方式 3、优缺点 1、定义与方法 （1）定义----利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按正确方向插入到载体DNA的方法，称为定向克隆法。 （2）操作依据----质粒载体一般都有多个限制酶的单一切点。 （3）方法----将外源DNA、pBR322同时用Hihd-III、BamH-I进行切割，那末，外源性目的基因、pBR322载体就会同时产生出Hihd-III粘性末端、BamH-I粘性末端。在进行退火时，外源性目的基因和载体之间就会按照粘性末端互补的原则进行连接。 (1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 2、连接方式 3、优缺点 优点----在连接过程中，只要外源性目的基因、载体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现象。 缺点：（1）若外源性基因不能以正确的方向插入到载体之中，则重组DNA在宿主中就不能表达。（2）反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。 （三）、载体脱磷克隆法 1、定义----载体DNA经过限制酶切割之后，再使用碱性磷酸酯酶水解，除去5-磷酰基，然后再与目的基因连接的方法，称为载体脱磷克隆法。 2、优点：（1）载体脱磷克隆法避免了载体DNA的自身环化现象，（2）也降低了载体DNA的线性聚合现象。（3）能够提高杂合重组率，也能够提高转化效率。 3、缺点----无法避免目的基因的自身环化+目的基因的线性聚合现象。 （四）、同聚接尾法 1、定义 2、方法 3、优缺点 1、定义 在载体DNA、目的基因DNA的两端分别接上能够进行互相配对的同一碱基聚合单链，然后进行重组的方法，称为同聚接尾法 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　　5′