临床诊断中的实时pcr技术.docVIP

临床诊断中的实时PCR技术 杜秀敏 齐法莲 徐军 克丙申 济南军区总医院实验诊断科 250031 目前，DNA分析技术已被广泛的应用于临床，包括分子遗传学、肿瘤学、微生物学、血液学及免疫学，其中许多技术依赖于靶分子的PCR扩增及扩增后分析，如限制性酶切与凝胶电泳以检测特异性扩增片段。这种定性检测重复性差，可靠性低，易给临床诊断带来混乱，而实时PCR的出现实现了DNA的定量分析，明显提高了诊断的特异性、灵敏度，快速、简单、自动、有效。有多种反应平台可以完成实时PCR分析，如Roche LightCycler、ABI Prism7700、PE 5700和超速热循环仪等。 1 实时PCR的生化特征 目前，许多实时PCR技术都基于同样的原理：即每产生一分子靶DNA即产生一个信号分子的改变，当足量的靶基因通过检测系统时就会产生信号的积累从而被检测。检测扩增过程的技术包括非特异性双链DNA染色和特异性探针杂交系统。 1.1 非特异性检测 染料（如SYBR Green I）结合到双链DNA上时能够产生很强的荧光信号。在PCR过程中，当染料结合到新合成的DNA分子上时，产生的递增信号就会被实时检测。当扩增反应完成时，通过缓慢加温双链DNA解链，结合其上的染料脱落导致信号下降从而被检测[1]。由于反应中每类DNA都有其特征性融链过程，从而可以提高检测结果的可靠性。但其主要缺点在于染料非特异地结合双链DNA，并不能区分引物二聚体及非特异性扩增产物，故应优化检测条件以降低扩增产物的非特异性。 1.2 特异性探针杂交系统 许多探针检测系统依赖于信号产生过程中荧光素介导的能量传递（FRET），FRET包括能量从一个供体分子到受体分子的非递减性能量传递，能量传递的效率与Dx106 成比例，D是供受体分子之间的距离。其它探针系统，如Taqman探针、分子信标与ScorpionTM 引物等，则依赖探针在游离状态下报告荧光基团与淬灭分子的接近使其荧光淬灭。当探针杂交到靶分子上时，由于杂交时的构型变化或Taq 聚合酶的5′核酸外切酶活性，报告基团的荧光素游离出来产生信号的增加。 Taqman探针系统包含一个探针序列，其两端各标记一个荧光素分子及淬灭分子。在PCR过程中，当探针杂交到靶序列上时，Taq聚合酶5′→3′外切酶活性剪去探针，继而荧光素与淬灭分子分离产生荧光信号的增加。 分子信标与Scorpion引物都包含一个发夹结构的探针序列（探针5′和3′互补），探针在游离状态下其5′的荧光素分子和3′的淬灭分子很接近。当杂交到靶序列上时，茎环结构张开，荧光素与淬灭分子分离产生信号的增强，研究表明，分子信标由于具有茎环结构而比Taqman探针具有更高的特异性[2]。 2 实时PCR的临床应用 2.1 基因型检测 FRET探针被用来检测α-抗胰蛋白酶抗体等位基因Pi*Z与Pi*S[3]，50多个个体被鉴定且所有基因型与PCR限制性片段长度多态性分析所得的结果相一致。 同样的方法用来分析凝血酶原突变与人类血小板抗原基因等[4,5]。Taqman探针检测系统是目前所有实时PCR中最成熟的技术，它在基因变异检测方面的应用已有广泛报道，较近的如检测凝血酶原及亚甲四氢叶酸酯（MTHFR）基因突变[6]。Taqman探针结合等位基因特异性引物可用来检测药物代谢酶类的多态性与HLA-DRB等位基因[7]。借助于ABI 7700，分子信标已被用来检测MTHFR基因中C677T突变，Scorpion引物被用做检测五个常见的囊纤维化基因突变子[8]。运用PE5700软件， SYBR Green I与PCR产物的结合能够定量线粒体DNA（mtDNA）[9]。 2.2 病原菌检测 FRET探针与Light Cycler被用于水痘—带状疱疹和疱疹单一病毒粒子检测[10]，其灵敏度高于培养分析法。Taqman探针系统被用于流感病毒的分型及脑膜炎双球菌DNA的检测，其灵敏度与特异性均高于培养分析法[11]。利用Taqman探针系统与ABI 7700检测慢性HBV感染病人中HBV粒子，其分析范围可达每毫升标本373-1010基因组拷贝，且室间与室内Ct的CV值分别为1.65%和1.85%[12]。在HBV的研究中，Taqman法被认为是具有高度重复性与灵敏度的，标本中只要每毫升含有10-109病毒拷贝就可被精确检测[13]。 2.3 定量mRNA 传统方法的灵敏度均达不到检测低表达mRNA的要求，因一些编码受体和内部信息分子的mRNA拷贝数极低，只能用定量逆转录（QRT）PCR方法，通过在不同反应管中加入内标，控制RT-PCR的扩增效率才能精确测定mRNA水平[14]。早在1988年Rappolce等人就将此法用于TGF-