分子克隆3—在大肠杆菌中表达克隆化基因.docVIP

在大肠杆菌中表达克隆化基因 导言 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 用T7噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 用?噬菌体PL启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号序列在大肠杆菌中分泌表达外源蛋白 附加方案：phoA融合蛋白的亚细胞定位 谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白 直链淀粉树脂亲和层析纯化麦芽糖结合融合蛋白 用固化Ni2+吸收色谱纯化带有组氨酸标签的蛋白 替代方案：用pH递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱多聚组氨酸标签蛋白 附加方案：NTA- Ni2+琼脂糖再生 从包涵体中纯化表达蛋白 附加方案：重折叠从包涵体提取的溶解蛋白 9 信息栏 克隆基因的表达 大肠杆菌表达系统 LacZ融合 离液剂 导言 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 引言 带异丙基-?-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导启动子的质粒表达外源蛋白的总量可以达到 全菌蛋白的30%以上。这些质粒非常适于实验室小规模操作，但IPTG价格昂贵，不能用于大规模制备外源蛋白。 实验方案 材料 缓冲液和溶液 考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG (1mmol/L) 1*SDS凝胶加样缓冲液 10% SDS 载体和细菌菌株 带有lacIq 或lacIq1等位基因的适于转化的大肠杆菌菌株 带有lacIq等位基因的IPTG诱导表达质粒可以转化实验室的任何大肠杆菌菌株（如JM1, DH5F’,TG1等）。 IPTG诱导的表达载体 阳性对照质粒（表达已知大小的LacZ融合蛋白的IPTG诱导载体） 培养基 （如何配制？分子克隆附录及科技出版社。） 含氨苄（50?g/ml）的LB琼脂平板 含氨苄（50?g/ml）的LB培养基 含氨苄（50?g/ml）的LB培养液 专用设备 沸水浴 振荡培养箱 细胞和组织 附加试剂 方法 含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建 PCR 含 重组质粒 通过 诱导靶蛋白表达的优化 对照菌和重组菌分别挑取1~2个菌落，接入1ml含氨苄青霉素（50?g/ml）的LB培养液，适当温度（20~37℃）培养过夜（~16h）。 大肠杆菌在室温的生长速度比在37℃慢4倍，所以~20℃培养过夜（~16h）可能达不到饱和。但低温时，细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。 取50?l过夜培养物接入5 ml含氨苄青霉素（50?g/ml）的LB培养液，20~37℃振荡培养2h以上（到底多少？是以经验时间，还是以A550来定？），至对数中期（A550=0.5~1.0）。 吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤9和10所述进行处理。 在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，20~37℃继续通气培养（是否还摇？）。（参见下面IPTG浓度和诱导温度的优化。） 影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。虽然在15~42℃之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围可能很窄，只有2~4℃。 温度有时对表达水平起着决定作用，而有时却对表达水平没有任何影响，这其中的原因还有待进一步研究，但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。由于这些不确定因素的存在，理论推断最佳生长温度是不可靠的，必须进行反复的实验。 IPTG的浓度度表达水平影响非常大。1mmol/L只是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中应该在0.01~0.5mmol/L的范围内改变IPTG浓度，寻找最佳使用浓度。 对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录，才不致使细菌的生物合成系统过载。 在诱导的不同时间（如1、2、4、6h）取1ml样品放于微量离心管中，测定A550，室温高速离心1min.(高速，具体是多少？) 沉淀悬于100?l 1*SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3min，室温高速离心1min，冰上放置，带全部样品处理完后上样。 样品加热至室温，取40?g或相当于0.15OD550培养物的悬液上样于10%SDS。 8~15V/cm电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带。 37℃诱导30min的阳性对照，有一条分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）带，GST的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带，诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于GST对照。 大量表达靶蛋白 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入含50 ml含氨苄青霉素（50?g/ml）的LB培养液，在250ml摇瓶中于20~37℃过夜培养。 取5~50ml 过夜培养物接入450~500ml含氨苄青霉素（50?g/ml）的LB培养液，在2L摇瓶中于20~37