分子生物学常用荧光核酸染料.docVIP

由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。这里的荧光核酸染料主要指能特异结合核酸并改变发光特性的化合物，DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料吧。除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂，它们能以非共价键的方式与DNA/RNA结合从而显示原位杂交中的细胞背景信息。根据它们能否穿透细胞膜进入活细胞体内，还可分为两大类：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。生物通在此简单比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。 分子生物学常用荧光核酸染料 荧光核酸染料在分子生物学最常见的应用无疑是电泳凝胶染色，以及定量PCR。 EBEB（溴化乙锭）本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。虽说以前的实验室里总会有个别做起实验来“精神可嘉，行为可怕”的家伙，一时找不到手套他们敢徒手拿EB胶，但大多数人对EB还是“敬而远之”的，没事谁都不愿靠近实验室里跑胶、看胶那一块地方。偏偏对于搞分子生物学的人来说，跑胶就像吃饭一样平常，于是大家只能硬着头皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早点出现在实验室。生物通在此简单回顾一下这几年纷纷登场的EB替代品。 SYBR系列染料说到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下Molecular Probes专利持有的SYBR系列。自1993年SYBR核酸染料推出以来，就因其灵敏度和易用性而迅速大受欢迎，成为明星产品之一。这一系列包括4种染料：SYBR Safe、SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II。 赫赫有名的SYBR Green I荧光染料是最早上市的EB替代品，这种致畸性低而相对安全得多的新染料在标准300 nm的紫外透射光下，能检测低至60 pg的dsDNA，比EB至少高了一个数量级。同时，SYBR Green I染料-DNA复合物的荧光量子产率约为0.8，相当于EB的5倍。SYBR Green I的使用和EB同样简单，而具有比EB更高的灵敏度，致变性也低得多（有个别宣传称之为几乎无毒），使之迅速成为替代EB的好选择如果不是贵得多的话就更好了。色如其名，结合DNA后会发出美丽的绿色荧光，在拍照时需要配套的滤光片。SYBR Green I亦即是定量PCR荧光染料法中广泛使用的荧光染料。为什么选择它，而不是灵敏度更高的SYBR Gold呢？那是因为SYBR Green I具有双链DNA的专一选择性。 SYBR Green II与SYBR Green I则刚好相反，它是检测RNA或单链DNA的高灵敏染料。尽管它不是RNA特异的，但SYBR Green II与RNA结合的荧光量子产率（~0.54）高于DNA（~0.36）。这个性质很特别，因为大部分染料都是与双链DNA结合时量子产率和荧光强度更高。与SYBR Green I相似，SYBR Green II也是在254 nm透射光下灵敏度最高。如果在300 nm透射光下，RNA检测的金牌恐怕还要颁给SYBR Gold。此外，SYBR Green II染料-RNA复合物的荧光不会被尿素或甲醛淬灭，因此在染色之前不必将变性剂洗脱。SYBR Green II可检测凝胶中低至100pg的ssDNA或者2ng RNA条带，特别适合SSCP分析和RNA分析。 SYBR Gold是这一系列中灵敏度最高的。它一旦结合核酸，荧光会增强1000倍以上，量子产率约为0.6。而EB仅为30倍，量子产量大约在0.15。因此，利用300 nm紫外透射仪和黑白成像，SYBR Gold检测凝胶中DNA和RNA的灵敏度比EB高10倍以上。色如其名，可以观察到金色的条带。SYBR Gold染料可用于检测包括双链DNA，单链DNA和RNA，适用于琼脂糖凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）研究，以及其他常规的分析。 SYBR Safe既然名为safe，自然是安全第一。它的诱变性比EB要低得多，但检测灵敏度与EB相当。使用方法也相同，既可以在制胶的时候加入，也可以在电泳后进行染色。SYBR Safe的激发峰在280和502 nm，发射峰在530 nm。因此，核酸被染色后，可通过标准的紫外透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪来查看。大家都知道，紫外光对DNA片段是有损伤的，Invitrogen曾做过实验，让1.25 kb的基因片段在紫外