东南大学转基因终期报告2013.docVIP

动物转基因技术进展 动物转基因技术是在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA重组技术的基础上, 运用基因工程等实验技术手段, 将分离得到的外源目的基因或重组基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞中, 使之整合到宿主细胞基因组内, 随细胞的分裂而增殖, 并稳定地遗传给下一代的一种生物技术。转基因技术开始于20世纪80年代, Jaenisch 等首次应用反转录病毒感染胚胎, 制备了转基因动物。随着新技术新方法的出现, 动物转基因技术也在不断的完善之中。利用传统的转基因方法, 如显微注射法、精子载体法、电穿孔法、脂质体介导法等, 已经制备了转基因小鼠、大鼠、猪、牛、羊、鸡等多种转基因动物。经过20多年的发展, 动物转基因技术在其多样性和实用性方面均取得了显著的进步, 尤其是近几年发展的几项新技术, 使转基因动物的研究产生了历史性的飞跃。通过生殖干细胞介导的转基因技术、对胚胎干细胞以及体细胞等进行基因打靶的定点整合转基因技术、RNA干扰介导的基因沉默技术以及诱导多能干细胞(iPS)技术, 提高了转基因动物制备效率, 使基因表达的精确调控成为现实。更多更新颖的动物转基因技术的出现, 使得转基因动物具有更加广阔的应用前景, 如制备动物生物反应器、提高畜禽生产能力及肉奶品质、培育抗病动物、生产人类用动物器官、建立人类疾病模型等, 将给人类带来巨大的经济效益。 1转基因动物的研究概况 Jaenisch(1976)等发现鼠的胚胎在反转录病毒的转染下,其基因组上能够插入病毒RNA染色体组的前病毒DNA序列,并采用反转录病毒载体法将Moloney氏鼠类白细胞病毒导入小鼠胚胎获得成功。但是没有意识到能够采用此法生产转基因动物。转基因动物的研究始于20世纪80年代,Goraon(1980)等将猴肾病毒—疱疹病毒胸腺激酶基因、SV40启动子克隆到pBR322载体,采用原核显微注射法注入到小鼠受精卵的原核内,获得了第一例转基因小鼠。Palmiter(1982)等将大鼠的生长激素基因和小鼠的金属硫因(mMT)启动子融合,采用显微注射法将带有小鼠mMT启动子的大鼠生长激素基因注入小鼠的受精卵中,获得“超级小鼠”。此后,转基因的研究工作取得了较大的发展。Hammer(1985)等分别获得了转基因兔、转基因绵羊、转基因猪。我国采用显微注射法将人的生长激素基因导入泥鳅和小鼠体内,获得转基因泥鳅(1985)和转基因小鼠(1986) 。上海生物所采用显微注射法将HbgAg—乙型肝炎表面抗原基因转移到兔胚胎中,获得转基因兔。Church(1986)获得转基因牛。Ebert (1991) 等获得转基因山羊。成勇(1997)将促红细胞生成素(EPO)和人乙肝表面抗原基因(Hbs- Ag)导入山羊,获得在乳腺中特异表达的转基因山羊。2001年北京兴绿原公司和中国农业大学合作,将人的乳铁蛋白基因和蛋白酶抑制基因重组为融合基 因,采用显微注射法导入山羊单细胞胚胎,体外培养后移植到受体母羊,成功获得了三只转基因山羊。目前,转基因动物是生物工程研究领域中最具活力和商业化前景的高新生物技术。 2　传统转基因动物的制作方法 转基因动物经过20多年的研究,探索了许多不同转基因方法。但其基本的生产技术过程包括外源目的基因的准备、外源目的基因的导入、携带目的基因细胞的筛选、选择合适的体外培养系统和宿主动物、转基因细胞的胚胎发育和鉴定、筛选转基因动物和新品系的建立、外源基因的表达和功能研究。转运外源目的基因是转基因动物生产中最重要的一个环节。根据基因转移的方法可分为显微注射法、反转录病毒载体法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞核移植技术。 2.1　原核显微注射法 显微注射法是最早采用的动物转基因方法,是由Cordon等1980年建立的。其基本过程是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中,使外源基因整合到受体细胞基因组内,再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育,从而获得转基因动物。目前,显微注射法仍然是最常用的转基因方法之一。自Palmiter(1982)等采用显微注射法获得转基因“超级小鼠”后,采用显微注射法分别获得转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼和转基因山羊。特别是在动物生物反应器中得到广泛应用:Ebert(1991)将人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)转移到山羊中,使htPA在山羊乳中表达,Swanson(1992)制备出血液中含有人血红蛋白的猪。此法对外源DNA分子的大小不受限制;但对技术要求高,成功率低,转基因随机整合,易造成受体基因组内生活必需的基因失活,导致胚胎或生物死亡;而且整合往往是多拷贝首尾串联重复连接,表达在不同的转基因个体间不稳定,不利于研究基因的