不同DNA提取方法汇总-哈尔滨工业大学.docxVIP

苏俊峰1，马放1，侯宁1，施波1，赵立军1，王弘宇21. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江哈尔滨 150090；2. 武汉大学市政工程系，湖北武汉 430072摘要：为了快速、简便和经济地获得活性污泥的总DNA，以用于分子生物学研究，采用5种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA，并通过提取的核酸总量、纯度、是否含有聚合酶链反应抑制剂等指标综合分析不同的提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明：蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取活性污泥总DNA效果最好，提取DNA总量多，纯度高，可不经纯化直接进行PCR扩增反应。关键词：活性污泥；DNA提取；聚合酶链反应中图分类号：X132 文献标识码：A 文章编号：1672-2175(2007)01-0047-03活性污泥是活性污泥法污水生物处理技术的主体，而研究活性污泥中的微生物群落对于探讨废水处理的反应机理、工艺改进、优化控制都具有重要意义[1]。传统的微生物培养周期长，工作量大，且被分离培养的微生物种类只占自然界微生物总量的1%左右，故其应用受到了很大的限制。近十余年来日益成熟的分子生物学技术给活性污泥的研究带来了新的希望。借助分子生物学技术可以进行特异的微生物的检测和鉴定，分析微生物群落的组成、结构和种群演替状况，建立高效、可靠的微生物总DNA提取方法是进行微生物分子生态学研究的基础, 有关从土壤、水体、海洋沉积中提取DNA的方法已得到较好发展[2-3]，但对从活性污泥中提取DNA的方法研究较少。DNA的提取根据破壁方法的不同可分为物理、化学和生物等多种破壁方法[4]，而不同的破壁方法裂解细胞，释放DNA的效率是不相同的，适宜的裂解方法是DNA提取成功与否的关键。由于活性污泥中除具有带有代谢活性的微生物群体外，还具有内源代谢、自身氧化的残留物；污水带入的难降解的有机物和无机物等物质，其中存在的腐殖物质等容易干扰DNA的检测, 这些污染可能抑制PCR中的Taq DNA聚合酶的活性，干扰限制性内切酶的消化，降低转化效率和DNA的杂交特异性等，因此高纯度的DNA对后续的工作有着重要影响。本文比较了5种不同的DNA提取方法，以提取的核酸总量、纯度、是否含有PCR酶抑制剂等指标来评价不同细胞提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响。1 材料和方法1.1 材料试验用活性污泥取自吉林化工污水处理厂曝气池.用250 mL预先灭菌的三角瓶盛装,取样后立即保存于4 ℃环境中，并于48 h内抽提活性污泥样品的DNA。取回后立即测定主要特征，得到：pH=7.1，30 min污泥的沉降比SV%=30%，污泥质量浓度MLSS=3.2 g/L。1.2 方法1.2.1　样本总DNA的提取取一定量的活性污泥液于10000 r/min下离心5 min, 沉淀以PBS缓冲液洗涤, 离心, 弃上清液,称取湿质量0.5 g的污泥于1.5 mL小离心管中, 500 μLPBS缓冲液重悬沉淀,采用以下5种方法提取污泥的总DNA。(1)蛋白酶K-SDS-酚氯仿法:：向离心管中加入300 μLDNA提取液(100 mmol/LTris，100 mmol/LEDTA，200 mmol/LNaCl，1%PVP，2%CTAB，pH8.0)和20 μL蛋白酶K，涡旋振荡混匀后放于37 °C水浴锅中保温30 min，加80 μL的10%SDS，65 °C水浴1 h，12000 r/min离心样品10 min，将上清移至另一1.5 mL离心管中。用酚和氯仿纯化DNA，乙醇沉淀后用TE溶解DNA。(2)柱提取DNA试剂盒法：用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行活性污泥总DNA提取。(3)溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法：加300 μLExtraction buffer和20 μL溶菌酶(10 mg/mL)，漩涡5 min，使样品充分悬浮。涡旋振荡混匀后放于37 °C水浴锅中保温30 min，加80 μL的10%SDS，65 °C水浴1 h，12000 r/min离心样品10 min，将上清移至另一1.5 mL离心管中。用氯仿异戊醇纯化DNA，乙醇沉淀后用TE溶解DNA。(4)反复冻融法[5](5)玻璃珠提取DNA试剂盒法：用Nucleic -Acid purification Kit进行活性污泥总DNA提取。1.2.2　DNA浓度、纯度和产量的测定及电泳检测用紫外吸收光谱法[6]测定产物DNA的浓度和纯度, 以λDNA(400 ng/μL)作为market，取2 μL提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳(goldview0.06 μL/mL)。1.2.3　PCR检查总DNA中的酶抑制剂　以5种不同提取方法的污泥基因组DNA作为PCR反应的模板, 采用16 SrRNA基因V3区特