抗体纯化及纯 度的检测课件2012.11.27.pptVIP

抗体纯化及纯度的检测 林 英 生物技术学院 2012.11.27 抗体纯化的方法 ①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。【其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法（聚蔗糖—泛影葡胺液 ）。 】 ②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。 核酸去除法 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法 例： 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。 ③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。 ④层析法— 凝胶过滤、离子交换、亲和层析 IgA相对分子量160,000，IgM相对分子量1000,000，故可通过分子筛将两者分开而得到纯品。 ⑤电泳— SDS一、硫铵盐析法 简便、蛋白质变性较少，33%饱和度的硫铵可以沉淀所有各类免疫球蛋白；缺点是分离的纯度较差，对IgA类抗体来说，浓盐可使其形成二聚体，不宜采用。 硫酸铵沉淀流程 样品 ↓ ↙硫酸铵粉末（20%） 搅拌 ↓ 静止放置1小时 ↓ 离心 ↙ ↘ 上清 沉淀 ↓↙硫酸铵粉末（80%） 搅拌 ↓ 静止放置2小时 ↓ 离心 ↙ ↘ 上清 沉淀（30%-80%硫酸铵饱和液） ↓ 缓冲液溶解 透析 二、Cohn冷酒精沉淀法： 四、硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法纯化IgG 在pH7.5的溶液中IgG带正电，其他血清蛋白带负电，因此阴离子交换剂DEAE-纤维素可以一次将IgG提纯到很高的纯度 四、IgM的纯化方法：18%饱和度硫铵沉淀+DEAE-纤维素柱层析法。 * * 一、原理 当高浓度盐存在时，蛋白质表面的电荷基团和极性基团与溶液中的离子配对，瓦解了以电荷为基础的蛋白质蛋白质相互作用。加之高盐能促进蛋白质表面疏水区的相互作用，形成蛋白质聚集体，并从水中分离析出沉淀。这一技术称为“盐析”。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的粗分离纯化。硫酸铵是分级沉淀蛋白质的一种极有用的盐，它具有保护蛋白质的活性、pH范围广、溶解度高、溶液散热少和经济适用等一些优良性质。 硫酸铵浓度常以百分浓度表示。以X%表示所要配制的溶液浓度，X0%表示开始的溶液浓度，所需的硫酸铵克数按以下公式计算： g=515× (X- X0)/(100-0.27X) (0℃时1L溶液) 试剂: 1. 硫酸铵 2. 10mM pH7.4的磷酸盐缓冲液 操作步骤 将硫酸铵晶体在乳钵中研磨成粉末状； 将盛有5ml蛋白质溶液（血液或消化液）的烧杯放在另一装有冰水的溶器内，并置于磁力搅拌器上搅拌； 加5mL生理盐水，边搅拌，边徐徐加入1.06g硫酸铵粉末至20%饱和； 在4℃放置1h后，用8000g离心20min； 取上清液转入另一烧杯，放在冰水的溶器内，在磁力搅拌器上边温和搅拌，边加入3.84g硫酸铵粉末至80%饱和； 4℃放置2h后，用8000g离心20min； 弃去上清液，取0.5 mL 生理盐水溶解沉淀； 装入透析袋，用0.0175mol/L PBS（pH 7.4）透析1d，期间换透析液6次。 凝胶过滤 ( 分子筛) 层析 三、层析分离 离子交换层析法 三、层析分离 将透析管剪成适当长度（10－20cm）的 小段，即透析袋。 2. 在大体积的2％（m/V）碳酸氢钠和1mM EDTA（pH8.0）中将透析袋煮沸10min。