201010承担单位：福建农科院农业生物资源研究所试验设计.DOC

2014-06-10 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：小菜蛾氨肽酶结构域 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2014-06-10 计数月份：2014年6月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施 6%-10% 设计不全，实验无果 11%-15% 设计可以，实施不全 16%-20% 设计完整，分布实施 21%-25% 实验不全，记载无果 26%-30% 实验不足，记载不全 31%-35% 独立实验，记载 36%-40% 分布实验，记载完整 41%-45% 目的明确，实验完成 46%-50% 实验完整，记载清晰 51%-55% 实验系统，结果可信 56%-60% 实验创新，分析清晰 实验创新，结论清晰 实验完整，统计清晰 71%-75% 实验系统，数据可靠 76%-80% 报告完整，文章雏形 81%-85% 结构合理，分析有据 86%-90% 逻辑清晰，统计合理 91%-95% 图表完整，写作流畅 96%-100% 文献完整，发表水平 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的苏云金杆菌( Bacillus thuringiensis) 是防治害虫的重要微生物杀虫剂,其产生杀虫毒素的基因也已被广泛用于培育抗虫的转基因植物。大量栽培的转Bt 基因植物在对小菜蛾、棉铃虫的防治中已发挥了重要作用。但是由于转Bt 基因植物在整个生长期都表达Bt 毒蛋白，持续地给害虫施加较高的选择压力，使很多害虫在不同程度上产生适应性的抗性进化,这种抗性风险已成为转基因植物能否在生产上持续有效应用的最严重威胁[1] ，因此必须实施配套的抗性治理方案，弄清抗性的分子机理是制订有效抗性治理对策与开展早期抗性监测所不可缺少的基础。 昆虫对Bt 毒素的抗性主要与昆虫中肠毒素结合位点的丧失或与毒素亲和性下降有关[2] 。在鳞翅目昆虫中氨肽酶N ()是Bt 毒素蛋白的一类重要受体，用RNA 干涉技术(RNAi) 抑制氨肽酶的表达可降低斜纹夜蛾对Bt 毒素的敏感性[3] ，将敏感昆虫的氨肽酶基因通过增强子捕捉技术在果蝇中肠表达可使原来对Cry1Ac 毒素不敏感的果蝇变得对毒素非常敏感[4] ，这些结果表明在Bt 毒素杀虫过程中氨肽酶、钙粘蛋白起着非常重要的作用。 superfamily Aminopeptidase N domain (51-523)和ERAP1-like C-terminal domain (592-903) domain的原核表达载体并进行原核表达，以期获得ERAP1蛋白，为研究小菜蛾对Bt基因产生抗性的分子机理打下基础。试验方法 小菜蛾中肠cDNA，感受态大肠杆菌DH5α。 LB液体培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去离子水定容至于1000 mL，灭菌后4℃保存（LB固体培养基加15g琼脂；Kanamycin-LB培养基加卡那霉素至终浓度为35μg/ml）。 扩增基因的引物由上海生工生物工程公司合成；琼脂糖凝胶（BIOWEST）；GoldView核酸染色剂（Solarbio）；质粒小提试剂盒（DP103）、琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209）、DNA Marker D2000 (MD114)购自天根生化科技有限公司；卡那霉素（KANA）购于 Sigma；限制性内切酶BglⅡ、，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase，T4 DNA ligase购自宝生物工程（大连）有限公司；原核表达载体pET30-(a)+购自Novagen；酵母提取物和胰化蛋白胨购自OXOID公司。 96孔全自动梯度PCR扩增仪（Applied Biosystems），SMTD-8222恒温水浴锅（精宏仪器有限公司），ST 16R （Thermo Scientific）， DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像仪（BIORAD）。 2.2.1 ERAP1全长基因的PCR扩增 根据 （Accession:GU213036）序列设计一对特异性引物，并在基因两端加上限制性酶切位点，：’（下划线为BglⅡ酶切位点）； R：’-CGCTCGAGTTAAATCGAATCTTTGT-3’（下划线为Ⅰ酶切位点）预计扩增片长度为bp；PCR扩增体系为：F 1μl，R 1μl， DNA 2μl，ddH2O μl，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 5μl；PCR程序为：95℃ 5min，98℃