皮肤变态反应试验操规.docxVIP

五、皮肤变态反应试验操规目的确定重复接触化妆品及其原料对哺乳动物是否可引起变态反应及其程度。 范围本操规用于动物皮肤变态反应试验的基本方法。 本操规适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。1 依据中华人民共和国卫生部《化妆品卫生规范第二部分第6章：皮肤变态反应试验》中华人民共和国国家标准《GB/T16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》。2 设备与耗材2,4-二硝基氯代苯，肉桂醛，2-巯基苯并噻唑或对氨基苯酸乙酯，弗氏完全佐剂、无菌水、80%乙醇、丙酮、刮毛器、脱毛膏、EP管外科手套、口罩、手术服、不同规格无菌注射器、一次性无菌纱布等。3 受试动物3.1 来源：西安交通大学实验动物中心3.2 动物种类：白化豚鼠20只：300～500 g，2~3月龄，雌雄兼半，雌鼠无孕。3.3 饲养条件：全价营养颗粒饲料喂食，自由采食，自由饮水，室温21±2℃，相对湿度40~70%。4试验步骤4.1材料制备受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为赋形剂，其它受试物可用 80%乙醇 （诱导接触）或丙酮（激发接触）作赋形剂。4.2试验方法4.2.1 试验准备a.取白化豚鼠20只，随机分成2组，对照组（10只），试验组(10只）、。适应环境一周后，正式试验前一天，每只豚鼠背前区备皮4cm×6cm。b. 无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应，并作完整记录。 c.试验方法可靠性的检查：实验开始前选两只备用豚鼠，使用4.2.1的局部诱导阶段方法进行预实验确定实验的可行性。4.2.1 试验过程（1）试验前约 24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为 4cm2~6cm2。 （2）局部诱导阶段对去毛区域采用75%酒精消毒，覆盖5层约8cm2的滴加适量样品浸提液的擦镜纸，使其贴敷在肩胛骨内侧皮肤上，再依次覆盖3*3cm大小的塑料薄膜、纱布，再用医用无刺激胶带固定使其不脱落封闭固定 6h。。观察记录敷贴后动物异常情况，第 7d 和第 14d 以同样方法重复一次。(对照组按照同样方法进行)(3 )激发阶段末次诱导后 14d~28d， 将约 0.2mL 的受试物涂于豚鼠背部右侧 2cm×2cm去毛区（接触前 24h 脱毛） ，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定 6h。(对照组按照同样方法进行)（4）动物观察激发接触后 24h和 48h 观察皮肤反应，按照表1给出的分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述和分级，将观察结果填写至表2.表1变态反应实验皮肤反应评级皮肤反应积分红斑和焦痂形成无红斑0轻微红斑（勉强可见）1明显红斑（散在或小块红斑）2中度~重度红斑3严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成4水肿形成无水肿0轻微水肿（勉强可见）1中度水肿（皮肤隆起轮廓清楚）2重度水肿（皮肤隆起1mm或超过1mm）3最高积分7表2试验结果组别动物号码时间24h48h试验组12345678910对照组111213141516171819205结果判定当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2 时，判为该动物出现皮肤变态反应阳性，按表 3 判定受试物的致敏强度。按表 3 判定受试物的致敏强度。如激发接触所得结果仍不能确定，应于第一次激发后一周，给予第二次激发，对照组作同步处理表3致敏强度致敏率（%）致敏强度0~8弱9~28轻29~64中65~80强81~100极强注：当致敏率为0时，可判断为未见皮肤变态反应6.豚鼠最大值试验6.1采用完全福氏佐剂（FCA）皮内注射方法检测致敏的可能性。6.2实验方法6.2.1 试验过程（1）动物数试验组至少用10只，对照组至少5只。如果试验结果难以确定受试物的致敏性，应增加动物数，试验组20只，对照组10只。（2）剂量水平诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度， 激发接触受试物浓度为不能（3）皮内诱导阶段按下图所示（A、B、C），在每只动物去毛的肩胛骨内侧从头向尾成对皮内注射0.1mL，共注射6个点。 三个对称点， 每点皮内注射0.1mL下述溶液。 试验组： A点 1：1（v/v）FCA/水或生理盐水的混合物。 B点 耐受浓度的受试物。 C点 用1：1（v/v）FCA/水或生理盐水配制的受试物，浓度与第2点相同。 对照组：注射部位同实验组。 A点 1：1（v/v）FCA/水或生理盐水的混合物。 B点 未稀释的溶剂。 C点 用1：1（v/v）FCA/水或生理盐水配制的浓度为 50%（w/v）的溶剂。 （4）局部诱导阶段将涂有0.5g（mL）受试物的2cm×4cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位，然后用两层纱布，一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布封闭固定48h。。对照组仅用溶剂作诱导处理