大创实验初步方案课件.docx

大创实验初步方案乙醛脱氢酶( ALDH) 是一类依赖于NAD( P) +的酶类，负责催化生物体内各种醛类转化为对应羧酸，该类蛋白质都含谷氨酸、半胱氨酸活性位点，根据蛋白质具体序列差异，生物中至今发现有22 个不同家族，其中植物13 个，不同家族酶类除了乙醛、丙二醛等通用底物以外，还有各自特异性底物，行使多方面的生物学功能。ALDH7 是乙醛脱氢酶家族中一类尤其保守的蛋白质，甚至在动植物之间也有高度的序列同源性，所以又被称为遗蛋白质( Antiquitin) 。人类ALDH7基因研究得比较透彻，确认在赖氨酸降解途径中负责α-氨基己二酸半醛( AASA) 的催化，所以该酶又被称为α-氨基己二酸半醛脱氢酶。植物中ALDH7 基因表达受到高盐、干旱等渗透胁迫的诱导，源于ALDH7 可以及时清除逆境中产生的有害醛类抵御活性氧( ROS) 的产生。拟南芥、水稻中过量表达自身ALDH7 可以显著提高植株对逆境的耐性，提高抗氧化能力［7］; 拟南芥、烟草中过量表达大豆ALDH7，也可提高转基因植株的抗氧化胁迫能力，这些研究进一步反映出该基因巨菌草属于禾本科狼尾草属植物，主要分布在非洲北部地区，1983 年由福建农林大学林占嬉研究员引进中国，经过30 多年的培育，已经成为一种适合我国南方气候土壤环境的草种。巨菌草适宜在25 ～ 35 ℃下生长，植株高大，直立丛生，产量高，糖及粗蛋白质含量高，抗逆性较强，既可作培养料栽培食( 药) 用菌，又可用于制作畜禽饲料，还可以用于水土保持、生物燃料、生物材料等领域的研究。巨菌草作为一种高产优质菌草，有很高的利用价值，值得推广，但其生长需要高温和湿润的土壤条件，而我国南方经常出现的不定期干旱不但降低了它的生产效益，同时也限制了它的进一步推广，因此需要对巨菌草的抗旱性进行一些基础性的研究。巨菌草育种及诱导处理1.育种本实验采用的是巨菌草种子（）。试验于2016年月日至月日在延安大学大学生命科学学院实验室内完成。育种过程为: 共准备40 个规格一致的圆形塑料盆，每盆盛有2 kg 土质一样的土，浇足充足的水份。每盆播撒十到十五颗种子，种植深度约三到四厘米，待全部长出芽后，选出芽长势较一致的21盆随机分成3组进行处理。在胁迫处理前每盆每天浇水至土壤保持湿润而土表没有积水。2.干旱诱导在胁迫处理前每盆每天浇水1 L，使土壤保持湿润而土表没有积水。长到2周后，第7 组巨菌草停止供水由其蒸腾作用开始进行自然干旱，胁迫天数为6 d; 1 d 后，第6 组巨菌草停止供水开始自然干旱，胁迫天数为5 d; 以此类推，直到第2 组巨菌草开始干旱胁迫，以此形成一个干旱胁迫梯度。第1 组巨菌草每天保持原有浇水量不变作为对照，胁迫天数为0 d。每个处理4 盆。2.1取样方法胁迫完成后取巨菌草幼苗顶端相同叶位的幼叶作为材料，剪碎叶片混匀，称取一定质量冷藏于－ 80 ℃保存备用。2.2测定指标及方法土壤含水量的测定采用烘干法，叶片的含水量和相对含水量测定采用饱和称重法，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G － 250 染色法，游离氨基酸含量的测定采用茚三酮显色法，脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法。每个指标重复测定3 次。3.结果及分析3.1干旱胁迫下土壤含水量的变化3.2干旱胁迫时间与叶片含水量关系3.3干旱时间与叶片相对含水量关系3.4干旱胁迫时间与可溶性蛋白含量关系3.5干旱胁迫时间与游离氨基酸含量关系3.6干旱胁迫时间与脯氨酸含量关系巨菌草RNA提取由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏RNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，