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ICS67.120.30 B50 DB22 吉林省地方标准 DB 22/ XXXXX—XXXX 水产品中炔诺酮的快速测定 酶联免疫法 Rapid determination of norethisterone in aquatic products-Enzyme linked immunosorbent assay method XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 吉 林 省 卫 生 厅发布 前言 本标准由吉林省卫生厅提出并归口。 本标准起草单位：长春市水产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：闫先春、杨炳坤、杨立军、王雅倩、修磊。水产品中炔诺酮的快速测定 酶联免疫法 范围 本标准规定了水产品中炔诺酮的酶联免疫快速测定方法,本标准适用于鲜活水生动物及初加工水产品的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水国家标准SC/T3016-2004 水产品抽样方法 原理 测定的基础是利用间接竞争ELASA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的炔诺酮和微孔条上预包被的偶联抗原竞争炔诺酮抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物炔诺酮的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中炔诺酮的残留量,从而达到定量或者定性的目的。 试剂与材料 二水合亚硝基铁氰化钠（分析纯）（组织专用） 七水合硫酸锌（分析纯）（组织专用） 乙腈（分析纯）（组织专用） 氢氧化钠（分析纯） 水应符合GB/T6682-2008规定的一级水标准。 0.36 M二水合硝基铁氰化钠溶液:称取10.7 g二水合亚硝基铁氰化钠加100 mL去离子水溶解混匀。 1 M七水合硫酸锌溶液:称取28.8 g七水合硫酸锌加100 mL去离子水溶解混匀 0.1 M氢氧化钠溶液:称取0.4 g氢氧化钠加100 mL去离子水溶解混匀 乙腈 0.1 M氢氧化钠溶液（组织样本专用）量取84 mL乙腈加入到16 mL 0.1 M氢氧化钠溶液中混匀 复溶工作液:用去离子水将2×浓缩复溶液按1︰12×浓缩复溶液+1份去离子水）用于提取样本的复溶。 洗涤工作液:用去离子水将20×浓缩洗涤液按1︰1920×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤。 试剂盒提供试剂包括：96孔酶标板、标准液、高浓度标准品、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液、20×浓缩洗涤液、2×浓缩复溶液。 仪器与设备 微孔板酶标仪 450 nm/630 nm 旋转蒸发仪/氮气吹干装置 均质器 振荡器 涡旋仪 离心机 天平：感量 0.01 g 刻度移液管：10 mL 洗耳球 玻璃试管：10 mL 聚苯乙烯离心管：2 mL、50 mL 微量移液器：单道 20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL、多道250 μL。 测定方法 制备与保存 抽样：按SC/T3016-2004的方法进行。 保存：样品经处理后，取可食部分（苗种取全身）100 g，用组织捣碎机捣碎，装入样品袋，标明标记，放入-18℃冰柜中冷冻保存。 提取纯化 6.2.1 称取2.0±0.05 g均质物至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入7 mL乙腈-0.1 M氢氧化钠溶液（组织样本专用）（见配液4.9），分别加入0.36 M二水合硝基铁氰化钠溶液（见配液4.6），1M七水合硫酸锌溶液（见配液4.7）各500 μL，用振荡器振荡10 min，3000 r/min以上，室温（20～25℃10 min; 6.2.2 取1 mL上清液至10 mL干净玻璃试管中，于50～60℃mL复溶工作液（见配液4.10）复溶干燥的残留物；把提取得到的样本液与复溶工作液按照1︰4μL样本液+400 μL复溶工作液），涡动混匀；取50 μL用于分析。 测定 将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 加标准品/样本和抗体工作液：加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中，再加入抗体工作液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃环境中反映30 min。 洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液4.11）250 μL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 加酶标二抗：加入酶标二抗100 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于37℃环境中反应30 min，取出重