电针介导的基因转移3.pdfVIP

( ) 中 　国 　科 　学 　 C 　辑 第 29 卷 　第 1 期 SCIENCE IN CHINA ( Series C) 　 1999 年 2 月 电针介导的基因转移 张继峰　秦阳君　付爱华　汤　健　陈光慧 (北京医科大学心血管基础研究所 ,北京 100083) 蔡　东　韩济生 (北京医科大学神经科学研究中心 ,北京 100083) 摘要 　　基因转移是实现基因治疗的关键技术之一 , 目前尚缺少简便、易行、有效、安 全的方法. 首次将我国传统的针刺技术与现代转基因技术结合起来 ,创建了一种电 针转基因的方法. 应用针灸针携带外源基因 ,经皮针刺 ,进行直流电刺激 ,可实现有 效的基因转移. 关键词 　　电针 　基因转移 基因治疗是许多先天性及获得性疾病治疗的一种重要途径 ,具有广阔的临床应用前景. 基因转移是实现基因治疗的关键技术之一 ,要求转移到靶细胞的基因能够安全、忠实并稳定表 达[1～3 ] . 目前体内转基因的方法主要分为病毒和非病毒介导的两大类. 病毒介导的基因转 移方法主要有 :重组腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒辅助病毒载体和单纯疱疹病毒载体 等 ;非病毒介导的方法主要有 :脂质体介导法、磷酸钙共沉淀法、DNA 沉淀埋植法、DNA 直接 注射法 ,还有本室建立的基因缝线法、基因球囊与支架、腺病毒脂体和受体介导法等. 这些方 法有的虽然简便易行 ,但转基因效率较低 ;有的转基因效率较高 ,但操作复杂 ,甚至可能有潜在 的毒副作用 ,应用范围受限. 为了使基因转移更加简便易行、易于推广 ,本工作将外源基因直 接粘涂在不锈钢针灸针上 ,通过皮肤刺入肌肉组织中 ,行针或电针 ,可实现局部组织的基因转 移 ,结果证实这种方法不仅简便易行 ,而且安全、有效、宜于推广使用. 1 　材料和方法 11 　质粒的构建 、提取和纯化 本实验所用的真核表达载体 ,pcDNA3/ 1acZ 和 pcD2/ pAdVAntage/ ANF 均由本室构建. 载体的结构如图 1 所示 ,均含有 CMV 启动子和 polyA 尾. 参考 Sambrook 等人[4 ] 的方法 ,用 碱裂解法提取质粒 ,经 PEG8000 纯化 ,分别根据内切酶图谱和 260 ,280 nm 光吸收进行鉴定 和定量. 12 　基因针的制作 依实验分别选临床使用的 1. 5 和 4. 5 cm 不锈钢针灸针 ,长度分别为 15 和 37 mm ,直径均 　　收稿 　　 国家“八六三”高科技计划基金资助项目 88　　　 ( ) 中 　　国 　　科 　　学 　　 C 　辑 第 29 卷 ( ) 0. 45 mm ,将针尖端 2/ 3 略加打磨使之成糙面 ,涂一层多聚赖氨酸 polylysine ,56 ku ,待干后 , 分多次涂粘上质粒DNA ,在消毒柜内吹干备用. 1. 5 和 4. 5 cm 不锈钢针灸针最多可分别荷载 μ 75 和 250 g 质粒 DNA. 我们将这种携带外源基因的针灸针称之为基因针或基因电针 ,见图 2 所示. 图 1 　质粒结构示意图 13 　基因针介导的 LacZ 基因在骨骼肌中的表达 13 1 　基因转移 　　本实验选用 18～20 g 雄性昆