实验一 核酸的提取.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 分子生物学实验Experiments of molecular biology 授课教师：田生礼 实验一 核酸的提取 实验一 核酸的提取（质粒DNA的提取和纯化） 【目的要求】 1．学习载体的基本结构 2．了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设计思想； 3．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术； 【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 【实验材料和用品】 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含有目的基因pADH的PMD-20T质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶。 注： pADH为多头绒泡菌乙醇脱氢酶 【实验步骤】 1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，37 ℃金属浴一个小时，然后储于-20℃冰箱中。 质粒电泳图 核酸的分离与纯化 不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 核酸的种类： 真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞器DNA为双链环状分子； 原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子； RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有ploy(A)结构;tRNA 的三叶草结构。 病毒的DNA、RNA，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。 一、核酸分离提取的原则 分离纯化核酸总的原则 ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染，保证较高纯度。 3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜： ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10条件下进行； ③减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素主要是机械剪切力，其次是高温。 ④防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各种核酸酶（ DNA酶、 RNA酶）酶解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。 其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活性。 而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。 提取高质量基因组DN