基于核酸适体检测atp 的酶联分析新方法 - chemical journal of .pdfVIP

Vol.35 高等 学校 化 学 学报 No.6 2014年6月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICALJOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES摇 摇 摇 摇 摇 摇 1161~1165 doi:10.7503/ cjc 摇 摇 基于核酸适体检测ATP 的酶联分析新方法 赵秋伶,刘玲玲,杨丽娜 (辽宁工程技术大学基础教学部,葫芦岛 125105) 摘要摇 基于核酸适体对靶标的特异性识别和辣根过氧化物酶(HRP)的高效催化反应,发展了一种用于检测 三磷酸腺苷(ATP)的酶联核酸适体分析新方法. 核酸适体和靶标的特异性结合导致与核酸适体杂交的短链 DNA解链,解离的DNA通过杂交被固定在另一酶标板的DNA捕获. 解离的DNA预先标记了异硫氰酸荧光 素(FITC)基团,FITC特异性结合HRP标记的FITC抗体,HRP作为信号传导元素催化四甲基二苯胺(TMB) 底物显色,通过颜色变化及450 nm波长处吸光度的变化检测ATP. 该方法对ATP具有良好的选择性,检测 不受其它物质如GTP,UTP和CTP 的干扰,且检测能在较复杂的试样(体积分数 10%和50%的血清)中进 行. 实验结果表明,在ATP浓度为50~400 nmol/ L范围内,具有良好的线性关系,检出限为26 nmol/ L. 关键词摇 核酸适体;酶联吸附分析;三磷酸腺苷(ATP);选择性;血清 中图分类号摇 O657郾1摇 摇 摇 摇 文献标志码摇 A 酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 是基于抗原和抗体的免疫反应和 酶的高效催化反应而建立的一种生物分析技术,已被广泛应用于医学诊断、生物分析、食品安全和环 境监测等领域[1~4]. ELISA凭借其灵敏度高、特异性好、成本低、速度快和仪器设备简单等优势得以迅 速发展;但是由于抗体稳定性差、分析结果重现性低以及存在交叉反应等缺点限制了其作为标准分析 [5] 方法的应用 . 核酸适体(Aptamer)是单链DNA或者RNA,通过指数富集配基的系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术从核酸文库中筛选得到,能高效和特异地结 [6] 合各种靶标 . 核酸适体有化学抗体之称,并具有常规识别分子(如抗体和酶) 所不具备的一些优点, 如可在体外通过化学方法批量合成并进行精确的化学位点修饰,有良好的化学稳定性以及热变性的可 回复性等[7~9]. 核酸适体的出现为生物分析方法和传感器的设计开辟了新思路. 用核酸适体代替抗体的ELISA方法称为酶联核酸适体分析(Enzyme linked aptamer assay,ELAA), 已发展的ELAA 的检测策略类似于ELISA,包括双抗夹心[10~13]和竞争分析[14,15]. 双抗夹心法适于大分 子如蛋白等的检测,因为大分子有足够的尺寸能同时结合2个识别元素形成夹心结构;竞争分析适合 小分子的检测,通常是样品中的靶标和酶标靶标竞争结合固相核酸适体,显色深者为阴性. 本文提出 了不同于双抗夹心和竞争分析的新检测策略,以三磷酸腺苷(ATP)为检测靶标,在与腺苷适体部分互 补的短链 DNA 上修饰异硫氰酸荧光素(FITC)基团,通过竞争反应使腺苷适体在两种状态间互相转 变. ATP 的加入导致 FITC鄄DNA从腺苷适体上解离,固定于另一酶标板上的DNA通过完全互补配对捕 获解离的FITC鄄DNA,FITC链接信号转导元素HRP使传感器产生比色信号. 本文提出的ELAA新策略 适用于检测小分子靶标,显色深者为阳性,结果观察准确方便. 该方法具有通用性,可拓展至其它具 有核酸适体的靶标物质,为多种生物分子的检测提供了新思路. 1摇 实验部分 1.1摇 仪器与试剂 Fluoro log3鄄21型荧光分光光度计(美国Jobin Yvon 公司);SpectraMax襅Paradigm襅多功能酶标仪 (美国Molecular Devices