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EASYspinPlus细菌RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用,仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用,仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用,仅用于体外 EASYspin Plus 细菌RNA快速提取试剂盒目录号:目录编号 包装单位 02 50次 适用范围:
适用于快速总RNA试剂盒组成、储存、稳定性:
试剂盒组成 保存 50次 室温 ml 溶菌酶 4℃ 20 mg 裂解液RLT室温 ml 去蛋白液RW1 室温 40 ml 漂洗液RW 室温 1ml第一次使用前按说明加指定量乙醇 70%乙醇 室温 9ml RNase-free H2O第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温 10 ml 室温
50套 RNase-free
吸附柱RA和收集管 室温 50套 本试剂盒在室温储存个月不影响使用效果。
储存事项:
所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
注意事项
所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
关于DNA 的微量残留:
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留本公司的EASYspinRNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和,如要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR我们建议在进行模板和引物的选择时:
选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
RNA 纯度及浓度检测:
完整性: RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA,电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb,分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍,否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280 读数(10mMTris, pH7.5)在-2.2 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品,假定在10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间,但这并不表示RNA 不纯。
浓度:取一定量的 RNA 提取物,用RNase-free 水稀释n 倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260, OD280 测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40操作步骤:
提示:
第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!
提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶的TE(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA),TE中溶菌酶浓度为1mg/ml。
离心收集ml菌液(约108-109细胞)到一个1.5ml离心管, 尽可能去除上清,注意残留的上清不能超过20μl。根据细胞的种类和数量,充分重悬细胞在100μl(5x108细胞)/ 200μl(5x108-7.5x108细胞) TE中TE中加入溶菌酶,浓度为1mg/ml,。室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶,破解细胞壁。
注意各种细菌破壁的难易程度不一样一般革兰氏阴性菌使用上面的条件就足够了,甚至可省略该步骤但是某些阳性B. subtilis难破壁
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