定向基因传递载体pET15bZVP1的构建.docVIP

　　定向基因传递载体pET15bZVP1的构建 【摘要】 目的 在JCV VP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区)，构建原核表达质粒pET15bZVP1。方法 PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将ZVP1片段插入原核表达质粒pET15b。结果 经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化，分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成ZVP1重组基因;双酶切将ZVP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，并经酶切鉴定和DNA测序证实。ethods The VP1 and Z fragment plified by PCR from plasmid pET15b and pEZZ18 respectively, and then they ent id pET15b by restriction enzyme BamHⅠ and NcoⅠ. Results The VP1 and Z fragment ent, VP1 and Z fragment, id pET15b betHⅠ and NcoⅠ sites, and confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of VP1Z ed by id pET15bZVP1 has been constructed successfully by inserting Z fragment into aminoterminal of VP1. 　　KEY acia Biotech公司，包含两个重复的Z片段，每个Z片段全长174bp。质粒pET15b购自Novagen公司，为含T7启动子的表达质粒，氨苄青霉素抗性，全长5708bp。 　　1.2 方法 　　1.2.1 扩增VP1片段 上游引物VP15′GCTCAGGCGCCGAAAATGGCCCCAACAAAAAG;下游引物VP13′GACAGGATCCTTACAGCATTTTTGTCTGCAAC。下游引物中引入BamHⅠ酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长1065bp。 　　用2μL质粒pET15bVP1为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性95℃ 2min 30s，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min 20s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(VP1片段)。 　　1.2.2 扩增Z片段 上游引物Z5′CTGCGCAACACGATGCCATGGTAGACAACAAA，下游引物Z3′ CTTTTTGTTGGGGCCATTTTCGGCGCCTGAGC。上游引物中引入NcoⅠ酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长174bp。 　　用2μL质粒pEZZ18为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性95℃ 2min 30s，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(Z片段)。 　　1.2.3 双重PCR连接Z片段和VP1片段 以胶回收的2μL Z片段和2μL VP1片段为模板，分别以Z5′和VP13′为上、下游引物，建立PCR反应体系。PCR反应条件为：预变性95℃ 2min 30s;变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min 20s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，回收目的DNA(ZVP1片段)。 　　1.2.4 将ZVP1插入pET15b 连接的ZVP1片段和质粒pET15b分别用BamHⅠ和NcoⅠ进行双酶切，酶切产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的DNA。胶回收的ZVP1片段和质粒pET15b应用T4DNA连接酶连接，4℃过夜，胶纯化连接产物。 　　1.2.5 连接产物的鉴定 重组质粒pET15bZVP1以BamHⅠ和NcoⅠ双酶切，20g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，进行双酶切鉴定;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切鉴定筛选出的阳性克隆质粒交给生物公司，使用T7和T7ter测序。 　　1.2.6 VP1Z的表达和纯化 应用热激发将重组质粒pET15bZVP1转化进入感受态细胞BL21