外周血P53基因SNP检测与宫颈癌早期诊断的关系.docVIP

　　外周血P53基因SNP检测与宫颈癌早期诊断的关系 【摘要】目的　分析宫颈癌发生过程中P53基因的突变作用，评估外周血P53基因突变分析作为宫颈癌高危对象筛查指标的实际应用价值。方法　用LDR-PCR技术对100例宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和100例健康人（对照组）的外周血P53基因第5-8外显子进行单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP)检测。 结果　CIN组和对照组的外周血P53基因的突变率为38%和0，差异有显著性（Plt;0.05）。 结论　P53基因突变在宫颈癌的发生过程中起重要作用，外周血P53基因SNP突变分析可望成为宫颈癌高危对象的早期诊断手段。 【关键词】　宫颈肿瘤　LDR-PCR　SNP　P53基因 宫颈癌是常见的妇科肿瘤，严重地威胁着女性的生命健康。大量流行病学研究证实，人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌发生发展的重要环境因素。然而在感染HPV的妇女中，大多数可自行消退，仅少数妇女发展为持续性感染，并进展为宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），甚至宫颈癌，这说明在宫颈癌的发生过程中，还有其他一些危险因素发挥作用。近年来研究表明，除环境与生活方式等外界因素外，宿主与病毒本身的变异因素很可能与疾病的发生发展有一定的相关性。深入理解HPV和宿主因素在宫颈癌发病机制中的作用及其相互关系，对于早期辨别存在HPV持续感染、宫颈病变可能恶性变的高危妇女具有重要意义。宫颈癌的早期诊断技术在宫颈癌的治疗中就起着重要的作用。宫颈细胞学检查是宫颈癌早期筛查的重要方法，40年代首先采用宫颈涂片细胞学检查诊断宫颈癌，称为巴氏涂片法。由于细胞学检查易受多种因素影响，如：取材刮片部位、取材工具、方法、标本染色过程及涂片诊断技术等，不可避免地会导致假阴性出现。通过各种努力，现在已发展到液基细胞学（TCT、TLT），将采集的标本放入保存液小瓶内送检，由仪器自动对细胞进行漂洗、离心、过滤，除去血液纤维、黏液等杂质后，自动制作出均匀的单层细胞涂片并染色，细胞学检查是宫颈癌的初筛手段，还存不足之处。P53 基因的缺失、突变和灭活在许多肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[1 ,2] 。P53基因突变在肿瘤组织中的普遍存在已经成为国内外学者广泛关注的课题。然而，在CIN患者中采用外周血SNP基因突变研究的报道甚少。我们用LDR-SNP 法对CIN患者进行外周血P53基因突变筛查，拟进一步验证宫颈癌发生过程中P53基因的突变作用，并初步评估外周血P53基因SNP分析作为宫颈癌高危对象筛查指标的实际应用价值。LDR-PCR测序分型技术连接酶检测反应 (ligase detection reaction，LDR)是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。先通过多重PCR (Multiplex PCR)获得含有待检测突变位点的基因片断，然后进行多重LDR (Multiplex LDR)，最后通过测序仪电泳读取检测结果 。 1　材料与方法 1.1 研究对象　标本 1.2 基因组DNA提取　应用常规饱和酚- 氯仿法提取基因组DNA。 1.3 SNP的选取及引物设计　选取P53基因5，6，7，8四个外显子区应用Primer 5软件设计引物( Sangon公司合成)。P53 的引物序列[5]: 第5外显子P1 : TCT GTT CAC TTG TGC CCT GAC TTT C; P2 :ACC CTG GGC AAC CAG CCC TGT CGT C。第6外显子P1 : CAG GGC TGG TTG CCC AGG GTC CCC A;P2 :ACT GAC AAC CAC CCT TAA CCC CTC C。第7外显子P1 :CTC CTA GGT TGG CTC TGA CTG T;P2 :GAG GCT GGG GCA CAG GCC AGT G。第8外显子P1: TAG GAC CTG ATT TCC TTA CTG CCT C; P2 :AAC TGC ACC CTT GGT TCT CTC CAC C。 1.4　PCR反应扩增目的片段　反应总体积25μL: 其中基因组DNA约40ng，10×反应缓冲液（MgCl215mmol/L） 2.5μL, dNTP（2.0 mmol/L）2.0μL, 上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL, Taq酶1U。循环参数: 94℃变性