草鱼不同类群淋巴细胞的分离及鉴定.pdf

维普资讯 第 20卷 第 l期 华 中 农 业 大 学 学 报 vd．∞ N0．1 2001年 2月 Joun~ 0fHuazho~ Agriculturalgniversity Feb 2001．63～66 草鱼不同类群淋巴细胞的分离及鉴定 罗晓春 李正秋 王金虎 张奇亚一 (中国科学院枣生生物研完所波枣生态与生物技术 目笨重点实验室，武汉430072) 摘要 用白细胞分离介质Hi~oque-10／7将草鱼外周血液中淋巴细胞分离后，依据它们对尼龙毛的牯附特性 分为粘跗性细胞和非粘附性细胞两个类群 。分别检测分离前 后的淋巴细胞的细胞表面超微结构、a一醋酸萘酯 酶活性及膜表面球蛋白。结果表明：表面粗糙细胞、旷醋酸萘醋酶阿性细胞和膜表面球蛋白阿性(Slg)细胞在外 周血液总淋巴细胞中的比例分别为47_8％、15．2％和538％，在粘附性淋巴细胞中的比例分别为823％、0l％ 和76．2％，在非牯跗性淋巴细胞中的比例为 18．3％、24．2％和25．5％ 关建词 草鱼；淋巴细胞； 醋酸萘醋酶；表面免疫球蛋白 中圈法分类号 S917；Q959．468 淋巴细胞异质性问题是鱼类免疫学领域研究的 洗尼龙毛柱后，即可使用。 热点之一口】，许多学者已从不同的方面对其进行了 经白细胞介质分离的外周血中淋巴细胞悬液 1 研究 。尼龙毛法是分离哺乳动物 T、B淋 巴细 加人事先制备好的尼龙毛柱中，25 孵育 1．5h 胞的有效方法，Xia等首先将尼龙毛法应用于鱼类，后，用 lO 199培养液分次洗下来粘附于尼龙毛上 将鳗鲡 的淋巴细胞分为两类 。本研究 以草鱼 的的淋巴细胞 ，洗脱时动作尽量轻缓，洗脱液收集于 (c d g口dD )为材料，对其不同类群淋 试管中；再用 lO 199培养液分次冲洗粘附于尼龙 巴细胞进行了分离及鉴定。 毛上的细胞，边洗边振荡，洗脱液收集于另一试管 1 材料与方法 中。粘附细胞和非粘附细胞悬液分别经2000r／min 离心 10rain，收集细胞沉淀。 1．1 材料鱼 1．4 扫描电镜观察 由中国科学院水生生物研究所关桥养殖场提 外周血液中淋巴细胞和经尼龙毛分离后粘附 供。将体重50—100g的2龄草鱼，驯养于25 、约 性、非粘附性淋巴细胞，分别用 2．5％的戊二醛固 盛有 1rn；水的水池中，备用。 定，磷酸缓冲液冲洗3遍，1％的锇酸固定 1—1．5h， 1．2 外周血液中淋巴细胞的分离 再用磷酸缓冲液冲洗 3遍，间隔 5min，用 50％、 从尾动脉抽取草鱼血 1、5 ，加肝素抗凝，置 70％、8o％、90％酒精梯度脱水各 1次，每次 10mill， 于事先已加入3ml自细胞分离介质 I-Iistoque一1077 100％酒精脱水2次，各20min。乙酸异戊酯置换 lO (Siena)的试管中，3000r／min离心25min后 ，吸取中 min，脱水完成后临界干燥2h，用粒子射击仪镀膜， 间的淋巴细胞层，加入适量的l99培养液洗涤，2000 AIVlRAY一1830扫描电镜(加速电压 20w)观察，照 drain离心 10min，收集细胞