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蛋白质分离纯化与鉴定技术 题记：上世纪七十年代，蛋白纯化一度受到冷落的现象将一去不复返了 报告内容 蛋白质分离纯化的常用技术手段 分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策 蛋白质的纯度及活性测定 有关蛋白质纯化的整体思考 应用举例 蛋白质分离纯化的常用技术手段 常用纯化技术 从上表可以总结出，蛋白分离纯化中的常用技术如下：絮凝、膜分离、细胞破碎、双水相萃取、盐析、柱层析、离心等。 絮凝技术 我国工业大规模发酵一般仍采用粗料发酵（料液中含豆饼粉、玉米粉等），发酵液含大量残留培养基，造成固液分离困难。絮凝技术可较好地解决这一问题。 絮凝技术：通过在发酵液中加入大分子物质（壳聚糖）和盐类，从而改变固体粒子的物理特性，使之聚合在一起形成更大的粒子而沉降，这一技术称为絮凝技术。 缺点：影响因素多，不同批次的发酵液组成及发酵时间对絮凝效果均有较大影响，放大困难。 前途：若使用精料发酵，则可放弃该技术。 膜分离技术 定义：膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其它组分，从而达到分离目的的技术。它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和省能等优点，已作为一种单元操作而受到人们的重视。 透析：它基于分子大小、分子构象与电荷、以浓度梯度为驱动力，通过水与小分子物质扩散达到分离浓缩的目的。 截留分子量的确定：选择截留率在90%那点对应的分子量作为该膜的截留分子量。由于各个厂家所用的标准品不同，所以很难把不同来源的膜的截留分子量作统一比较。 膜分离的优缺点 优点：具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和省能等优点。 缺点： 1：分辨率不高，很难把分子量很近的分子分开。一般要求两个分子的分子量相差10倍以上。 2：膜污染 膜污染：分离中的物质通过化学和机械作用，引起膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过量与分离特性不可逆变化的现象。膜一旦接触待分离的物质，膜污染就已开始。膜污染现象限制了膜的推广应用。 细胞破碎常用方法 物理法：珠磨法、高压匀浆法和超声破碎法等。 化学法：酶溶法、螯合剂法、溶剂法等。 珠磨破碎细胞法 利用珠磨机内大量的玻璃珠在搅拌桨的作用下通过碰撞、剪切等作用撕破或磨碎细胞以达到胞内产物释放的方法。珠磨机物料的出口处设有夹缝或筛孔板用以截留玻璃珠，从而实现连续操作。 优点：处理量大，与高压匀浆法比，更容易进行温度控制。 缺点：样品有一定程度的损耗，破碎程度较难控制。 高压匀浆破碎细胞法 利用高压破碎细胞，其原理为：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬液经过阀坐的中心孔道从阀坐和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达每秒几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列的过程中经历了高速造成的剪切、碰撞、以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。 优点：处理量大、设备简单。 缺点：破碎条件剧烈，易造成蛋白失活，噪音大。 超声波破碎细胞法 原理：通过空化作用破碎细胞。 优点：设备简单，可快速处理小批量样品。 缺点：不适宜处理大量样品，温度不易控制，超声产生的自由基可导致某些蛋白失活。（思考） 双水相萃取 萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术。 有机溶剂萃取：有机溶剂从水中萃取物质。 反萃取：水溶液从有机溶剂中萃取物质。 以上萃取的共同点是：萃取反应中的两相性质差异显著，表面张力大，易导致物质失活。 双水相萃取：因两种水溶性聚合物的水溶液或一种水溶性聚合物的水溶液与盐液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。 优点：萃取条件温和[两相均含有大量水（80%以上）界面张力小]；生物相容性好，有时还有稳定作用；分配系数可控（相系统组成、聚合物修饰）；易于放大（几百上千倍）。 缺点：系统中较高浓度的水溶性聚合物和盐会带到产物中，去除需要辅助方法。 应用举例 聚乙二醇/葡聚糖系统：9% PEG 4000 / 1.25% DEX 1500, PH 7.8 聚乙二醇/盐系统：聚乙二醇/磷酸钾、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠、琥铂酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠。 真核细胞表达的beta-IFN经双水相萃取，提纯了630倍。 可能的应用 超声上清→PEG/盐系统→疏水层析 盐 析 常用的为硫酸铵沉淀，实际上很多种盐对蛋白均有沉淀作用，如硫酸钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。上述盐类对蛋白的沉淀能力，对系统PH值的影响均有不同，可根据实际情况进行选择。 色谱—层析 色谱柱基本理论 塔板理论 最早由化工专家提出，认为可以将一根色谱柱看作是一根精馏柱，它由许多级蒸馏的小塔板或小短柱组成。这种假想的小塔板或小短柱越小或越短，就意味着在一个精馏塔或分离柱上允许反复进行平衡的次数就越多，即具有更高的分辨率。 塔板数的计算 为便于比较，一般要